大柴胡汤加减方对湿热证胆囊胆固醇结石小鼠胆固醇代谢基因SRBI、ABCG5/G8表达的影响

王素英，章小燕，闵 莉*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.福建省中医健康管理2011 协同创新中心，福建 福州 350122；3.中医健康状态辨识研究室，福建 福州 350122）

我国胆结石发病率逐年增多，其中胆囊胆固醇结石（cholesterol gallstones，CS）是临床最常见的胆囊结石类型，故进一步研究CS 的发病机制对指导其临床防治意义重大［1-2］。胆结石形成机制复杂且不完善，胆固醇代谢异常致使胆汁内胆固醇过饱和是CS 发生的重要机制之一［3-5］。肝脏主司胆汁分泌，是胆固醇合成、吸收、外排的重要场所。研究发现，血清中高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）可能是致石性胆汁内胆固醇的主要来源；B 类清道夫受体Ⅰ（scavenger receptor class-B typeⅠ，SRBI）是HDL-C 的重要受体，可将其逆转运至肝脏，促使肝脏分泌的胆汁内胆固醇增多，进而导致CS 的发生［6-8］。三磷酸腺苷结合盒转运体G5/G8（ATP binding cassette transporter G5/G8，ABCG5/G8）促进肝脏内胆固醇外排入胆囊，是诱发CS 的重要基因［9］。

中医认为胆石症常伴湿热［10］。大柴胡汤源自《伤寒论》，具有清热祛湿、利胆消石之效，是治疗CS 湿热证的常用药与代表方［11-12］；现代研究证实大柴胡汤具有保肝、利胆、降脂等作用［13］。大柴胡汤加减方（modified dachaihu decoction，MDD）为2020年胆石症湿热证的中医诊疗指南中推荐用药［12］，可调节FXR/FGF15/FGFR4 通路，对CS 湿热证小鼠起到良好的治疗效果［14］。据此，本次实验拟通过构建CS 湿热证小鼠模型，从肝脏胆固醇代谢相关基因SRBI、ABCG5/8 的表达差异，进一步探究MMD 治疗湿热型CS 的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 C57BL/6J 雄性小鼠24 只，体质量（18±2）g，购自杭州子源实验动物科技有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（浙）2019-0004，在福建中医药大学实验动物中心SPF 级动物实验室适应性喂养1周，实验动物使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。本实验方案通过福建中医药大学实验动物伦理委员会审查批准（审批号：FJTCM IACUC 2020071）。

1.2 实验药物及饲料 大柴胡汤加减方由柴胡15 g，黄芩10 g，茵陈15 g，郁金15 g，金钱草15 g，茯苓15 g，厚朴10 g，枳实10 g，生大黄6 g 和炙甘草6 g 组成，购自福建中医药大学附属第三人民医院中药房。以上中药水煎煮2 次、浓缩为含生药1.17 g/mL 的大柴胡汤加减方药液。熊去氧胆酸胶囊（Losan Pharma GmbH 公司，批号：L20182A）购自福建中医药大学附属第三人民医院西药房，将胶囊打开用超纯水溶解，配制成浓度为2.5 mg/mL 的熊去氧胆酸溶液。常规饲料由福建中医药大学实验动物中心提供。2%高胆固醇致石饲料（成分：全价饲料粉料82.5%、牛油15%、胆固醇2%、胆酸0.5%，批号：20210107）购自无锡帆泊生物技术有限公司。

1.3 实验试剂 小鼠总胆固醇（TC）、总胆汁酸（TBA）、磷脂（PL）、HDL 酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒均购自江苏酶免实业有限公司，批号：M202101-18、M202101-45、M202101-32、M202110-26）；苏木素-伊红（HE）染色试剂盒（上海源叶生物科技有限公司，批号：J05N11Y130004）；GAPDH 一抗（批号：10015666）、SRBI 一抗（批号：00091630）、鼠二抗（批号：20000261）、兔二抗（批号：20000250）均购自武汉三鹰生物技术有限公司；ABCG5/G8 一抗（美国Affinity Biosciences 公司，批号：88X7997、41W9164）；逆转录试剂盒、SYBR 试剂盒均购自日本TAKARA公司，批号：AK71623A、AK41790A。

1.4 实验仪器 人工气候箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；体视显微镜（重庆奥特光学仪器有限责任公司）；生物组织包埋机、石蜡切片机（德国Leica 公司）；多功能酶标仪（瑞士Tecan 公司）；基因扩增仪、ABI 荧光定量PCR 仪（美国Applied Biosystems 公司）；超微量紫外分光光度计（美国Thermo Scientific 公司）；化学发光凝胶成像系统（美国Bio-Rad 公司）。

2 方 法

2.1 动物分组及造模 按照体质量分层随机分组法将适应性喂养1 周后的雄性小鼠24 只分为空白组、模型组、中药组和西药组，每组各6 只。空白组常规饲养；其余3 组小鼠采用“2%高胆固醇致石饲料＋内湿＋外湿”的方法造模13 周，建立CS 湿热证模型，即造模全周期始终予以2%高胆固醇致石饲料喂养，第10～13 周每天增加10 h 的外部湿热环境（人工气候箱设置的温度31～33 ℃、湿度95%的环境）影响，在处于湿热环境的同时给予20%蔗糖水。若小鼠出现嗜卧懒动、精神不振、体质量增长减缓、饮食减少、大便质软、小便短、皮毛油腻稀疏等表现，经解剖后观察到胆囊结石即可判定为CS 湿热证造模成功［14］。

2.2 药物干预 造模成功后，所有小鼠按照体质量0.02 mL/（g·d）计算灌胃量，根据课题组前期研究基础及体质量等效剂量换算公式［14-16］，中药组和西药组小鼠分别给予1.17 g/mL 大柴胡汤加减方药液和2.5 mg/mL 熊去氧胆酸溶液灌胃，空白组和模型组则予以生理盐水灌胃，共干预4 周。

2.3 取材 末次干预结束后禁食不禁水12 h，采用摘眼球取血法，收集小鼠血液样本，离心后取其血清至新的EP 管内并做好标记。随后将小鼠颈椎脱臼处死、解剖，摘取完整胆囊，并用生理盐水洗净后，置于体视显微镜下观察、拍照记录，随后保存胆汁。最后摘取小鼠肝左叶，将其切成3 个方块，1 块置于4%多聚甲醛固定液中用于后续HE 染色观察，另外2 块置于EP 管内冻存于-80 ℃冰箱用于后续mRNA 和蛋白表达量的检测。

2.4 观察指标

2.4.1 小鼠一般情况及胆囊结石观察 参考课题组前期及他人研究［14，17］，自造模起每周观察记录小鼠的精神状态、活动度、体质量、饮食［18-19］、皮毛、二便等变化情况，造模前后及干预后进行旷场实验［20-21］，即准备2 个同等规格的白色敞箱（50 cm×50 cm×50 cm，底面被划分成大小均匀的25 个方格），夜间在黑暗的房间内同时开始2 组小鼠实验（每组4 名操作者），1 名操作者将小鼠放于敞箱中央，其余3 名操作者不被告知小鼠组别，并分别观察记录5 min 内小鼠水平穿越格子数、直立次数和静止时间，以辅助判断4 组小鼠湿热证候。解剖小鼠摘取其完整胆囊，观察、记录4 组小鼠胆囊结石情况。

2.4.2 胆汁成分与血清血脂含量测定 参考ELISA试剂盒说明书，设置标准孔、样品孔与空白孔，依次加入不同浓度的标准品、样本（胆汁/血清）、蒸馏水各50 μL，除空白孔外，各孔加入HRP 标记的检测抗体100 μL，37 ℃温育后重复洗涤5 次，再往所有孔加入底物A、B 各50 μL，37 ℃避光孵育后，加入终止液50 μL，在450 nm 波长处测定各孔的吸光值（OD 值），计算胆汁中TC、TBA、PL 和血清中TC、HDL 含量。

2.4.3 肝组织病理形态学 将肝组织石蜡标本切片（厚度约4 μm）、采用HE 染色，中性树脂封片，光镜下观察肝组织病理形态学改变。

2.4.4 qPCR 检测肝组织中SRBI、ABCG5/G8 mRNA相对表达水平 将肝组织研磨成浆，提取组织内RNA 并测定其纯度和浓度。在逆转录试剂盒说明书的指导下操作，去除基因组cDNA 并将提取的RNA 逆转录为cDNA。根据SYBR 试剂盒的说明，配置反应液与cDNA、所测目的基因引物（PCR 引物及内参由福州瑞真生物技术有限公司设计合成，见表1）混合加样，依次进行预变性（95 ℃/30 s）、变性（95 ℃/5 s）、退火（60 ℃/30 s），共40 个循环，完成PCR 扩增。以GAPDH 为内参对照，根据各样本的Ct 值，计算2-ΔΔCt代表SRBI、ABCG5/G8 的mRNA 相对表达量进行后续统计分析。

表1 引物序列

2.4.5 Western blot 检测肝组织SRBI、ABCG5/G8 蛋白表达量 提取小鼠肝脏组织总蛋白并用BCA 法检测浓度，配置10%PAGE 凝胶，往泳道内依次加入Marker 和4 组蛋白样品、电泳（浓缩胶30 V/30 min，分离胶90 V/90 min）后将蛋白条带转至PVDF 膜上（250 mA/60 min），再分别经GAPDH、SRBI、ABCG5、ABCG8 一抗（1∶10 000、1∶800、1∶3 000、1∶3 000）4 ℃孵育过夜，洗涤后鼠、兔二抗（1∶5 000）孵育2 h，清洗干净在ECL 避光条件下显影、成像，以条带上SRBI、ABCG5/G8 蛋白的灰度值/GAPDH 蛋白的灰度值，代表相应4 组SRBI、ABCG5/G8 蛋白相对表达量进行后续统计分析。

2.5 统计学方法 采用SPSS 26.00 软件对数据进行分析，GraphPad Prism 8 软件进行数据图片绘制。计量资料符合正态分布以（±s）表示，2 组比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 4组小鼠一般情况比较 空白组在整个造模与干预期间，精神状态良好，好攀爬、较为活跃，平均饮食摄入量稳定，体质量逐步增长，二便正常，皮毛柔顺无缺损。造模的3 组在造模1～9 周时，精神状态尚好，少在笼内走动、好聚堆，饮食量和体质量增长均明显高于空白组小鼠，皮毛油腻成绺，大便质软；在造模10～13 周时，3 组陆续出现精神萎靡、嗜卧懒动，常聚堆于角落或藏匿于垫料下方，饮食量明显减少，体质量下降，眵多，皮毛油腻稀疏且常因啃咬而出现皮毛块状缺损，小便色深黄味重，大便稀软常不成形，表现出明显的湿热证候。干预后，中药组精神状态有所改善，常在笼内走动、活动度增高，饮食量和体质量增长有所恢复，小便淡黄，大便成形，皮毛柔顺完整、眵少，湿热证候明显改善；模型组与西药组无明显变化。见图1。

图1 4 组小鼠一般情况比较

3.2 4 组小鼠胆囊结石情况比较 空白组胆囊体积适中，胆汁淡黄清澈、透光度高、无杂质。与空白组相比，模型组胆囊内肉眼可见沙粒样结石沉淀，胆汁颜色变深呈棕褐色，胆囊体积增大。中药组和西药组胆囊体积较空白组均增大，胆汁颜色较深；与模型组比较，中药组和西药组胆囊内结石消失，胆汁浑浊程度降低，以中药组小鼠胆汁透明度更高。见图2。

图2 4 组小鼠胆囊结石情况

3.3 4组小鼠胆汁TC、TBA、PL含量比较 见表2。

表2 4 组小鼠胆汁TC、TBA、PL 含量比较（±s）

表2 4 组小鼠胆汁TC、TBA、PL 含量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05；与西药组比较，3） P＜0.05。

组别空白组模型组中药组西药组n 6 6 6 6 TC/（mmol/L）4.81±0.39 9.41±0.371）6.67±0.362）7.57±0.832）TBA/（μmol/L）19.62±0.45 12.86±1.251）16.72±0.722）15.86±0.982）PL/（ng/mL）194.56±8.31 104.68±13.921）164.39±13.492）3）144.19±14.722）

3.4 4组小鼠血清HDL-C、TC 含量比较 见表3。

表3 4 组小鼠血清中HDL-C、TC 含量比较（±s）

表3 4 组小鼠血清中HDL-C、TC 含量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

TC/（mmol/L）2.00±0.32 7.23±0.201）5.22±0.472）6.19±1.122）组别空白组模型组中药组西药组n6 6 6 6 HDL-C/（μmol/L）169.80±2.43 122.16±6.181）146.45±2.612）141.83±7.712）

3.5 4组小鼠肝组织病理学形态 空白组肝细胞形态结构正常，细胞核大而居中，细胞间排列紧密、有序；模型组肝细胞肿胀变形，胞质内充斥大量的脂滴空泡，细胞核多被挤至细胞边缘，细胞间排列松散、混乱；中药组、西药组肝细胞内脂滴空泡明显减少、变小，肝组织脂肪样变性明显减轻，细胞间排列相对清楚，其中中药组肝脏组织形态更趋近于正常组。见图3。

图3 4 组小鼠肝脏组织形态（HE 染色，×200）

3.6 4组小鼠肝组织SRBI、ABCG5/G8 mRNA 表达水平比较 见表4。

表4 4 组小鼠肝组织SRBI、ABCG5/G8 mRNA相对表达水平比较（±s）

表4 4 组小鼠肝组织SRBI、ABCG5/G8 mRNA相对表达水平比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

ABCG8 1.01±0.02 2.18±0.101）1.50±0.442）1.93±0.38组别空白组模型组中药组西药组n6 6 6 6 SRBI 1.03±0.04 2.25±0.401）1.37±0.162）1.47±0.202）ABCG5 1.05±0.04 2.19±0.041）1.53±0.46 1.95±0.13

3.7 4组小鼠肝组织SRBI、ABCG5/G8 蛋白表达量比较 见图4、表5。

图4 4 组小鼠肝脏SRBI、ABCG5/G8 蛋白条带图

表5 4 组小鼠肝脏SRBI、ABCG5/G8蛋白表达量比较（±s）

表5 4 组小鼠肝脏SRBI、ABCG5/G8蛋白表达量比较（±s）

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

ABCG8 0.18±0.05 0.41±0.022）0.30±0.032）0.24±0.022）组别空白组模型组中药组西药组n6 6 6 6 SRBI 0.29±0.02 0.52±0.191）0.40±0.07 0.49±0.08 ABCG5 0.10±0.04 0.24±0.12 0.21±0.13 0.23±0.10

4 讨 论

CS 属中医学“胆胀”“胁痛”“黄疸”等范畴，因湿热、痰瘀、气郁、虫毒、阴虚等多种病理因素相互作用、影响，胆汁排泌不畅，而日久淤滞成石。研究发现，湿热壅滞乃胆石症关键病机及临床常见证型［22-23］；故采用清热祛湿、利胆消石之法为主对CS进行治疗，临床亦常用大柴胡汤为基础方随症加减治疗CS 湿热证且疗效颇佳［24-26］。本次研究选用的大柴胡汤加减方源自胆石症湿热证中医诊疗指南推荐用药［12］，在原方的基础上，去半夏、白芍与姜枣，加郁金与柴胡共解肝胆之郁，配以茵陈、黄芩清利少阳、阳明之湿热；厚朴与枳实相配，可强化燥湿行气之效；轻用生大黄泄阳明壅滞之湿热，重用金钱草加强清热祛湿、利胆消石之效；茯苓利水湿、健脾胃，与炙甘草共为佐药，可调和诸药。全方以攻为主，涤壅滞之湿热，疏肝胆之淤，又注意顾护脾胃，是清热祛湿、利胆消石之佳剂。

现代医学研究发现，胆汁中胆固醇过饱和是CS 发生的关键机制，也是其突出的病理表现［3-5］。胆汁中的成分主要有TC、TBA、PL，若胆汁成分比例异常，即TC 增多或TBA、PL 比例降低均会导致胆汁中胆固醇过饱和析出形成CS［5，27-28］。经临床及动物实验发现，CS 患者/小鼠血脂成分异常，血清中TC 含量异常升高而HDL-C 含量则明显降低［29-30］。TC 的血清浓度可反映机体脂代谢情况，与饮食关系密切；HDL-C 与SRBI 特异性结合逆转运胆固醇至肝脏被认为是CS 患者胆汁中胆固醇的主要来源［6-7，31］。ABCG5/G8 参与转运肝脏内胆固醇至胆囊，与CS 的发生、发展密切相关［9］。肝脏是胆固醇代谢的重要器官，若脂质代谢异常，肝脏组织形态则可能发生异常。本次实验中，模型组小鼠肝脏脂肪变性明显，胆汁中TC 含量显著增多、TBA和PL 含量显著下降，血清TC 含量升高、HDL-C 则显著降低，且肝脏中SRBI、ABCG5、ABCG8 mRNA与蛋白表达均有上调趋势，与上述研究报道一致。

薛生白曰：“内外相引，故病湿热”，故本次实验在湿热模型制备时，兼顾了内外湿热因素的影响。造模的小鼠长期食用2%高胆固醇致石饲料，属膏粱厚味，滋腻滞碍脾胃，使其运化无权，而生湿热；同时，高胆固醇高脂饮食是诱发CS 的重要危险因素［32］，通过长期饮食因素的干扰，既保证了CS 模型的建立又促使湿热内生。康洁和高碧珍［33］认为塑造病证结合动物模型，应该先确保“病”已形成后，再建立“证”模型，如此病症模型才会稳固。根据课题组前期研究结果，高胆固醇致石饲料喂养小鼠9周便可形成CS［15，34］。故本次实验在造模10～13周增加外部湿热环境因素的干扰，同时给予小鼠20%糖水进一步增加内湿因素的影响。结果显示，模型组小鼠胆囊内出现肉眼可见的沙粒样结石沉淀，胆汁颜色变深、胆囊体积增大，即CS 模型建立成功。现阶段关于动物湿热证模型的评价尚无统一的规范化标准，所以本次研究中，以中医学在临床中人的湿热证候表现为参照，来评判动物湿热证模型建立是否成功。在造模10～13 周，造模的3 组小鼠均表现出精神萎靡，嗜卧懒动，饮食减少，体质量增长迟缓，小便黄赤，大便稀软，面垢眵多，皮毛油腻稀疏等表现，与《脾胃论》中记载的湿热证候表现“人感之多四肢困倦，精神短少，懒于动作，胸满气促，肢节沉疼……小便黄而数，大便溏而频……不思饮食”高度契合，表明造模的3 组小鼠表现出明显的湿热证候。经大柴胡汤加减复方干预后，小鼠的湿热证候较模型组与西药组明显改善。

熊去氧胆酸是临床治疗胆结石的常用药，具有调节脂质代谢、利胆、消石之效［19，24］。因大柴胡汤加减方亦有上述功效［12-13］，且更添清热祛湿之用，故通过将中药组与西药组治疗效果进行比较，可以较为直观地阐释大柴胡汤加减方治疗CS 的作用机制，并从方证对应的角度进一步验证CS 模型小鼠的湿热病理。故实验结果显示中药组小鼠胆汁结石状况、湿热证候、肝脏脂肪病变程度、血脂含量、胆汁成分及SRBI、ABCG4/G8的mRNA与蛋白表达情况的改善程度整体上均优于西药组，且更趋近于空白组。以上差异无统计学意义，可能是由于样本量较少的缘故。

综上表明，SRBI、ABCG5/G8 表达异常升高可能是CS 湿热证的分子生物学机制之一。大柴胡汤加减方能通过抑制SRBI、ABCG5/G8 的表达，调节胆固醇代谢，减少胆固醇过饱和胆汁的分泌，改善肝脏脂肪变性，发挥清热祛湿、利胆消石的作用，从而达到治疗湿热型胆石症的效果。