清解扶正颗粒通过PI3K/AKT通路抑制宫颈癌Caski细胞移植瘤的生长

刘 洁 ，彭 娇 ，赵锦燕 ，2，3，林明和 ，林久茂 ，2，3*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.中西医结合基础福建省高等学校重点实验室，福建 福州 350122；3.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建 福州 350122）

宫颈癌是一种多发于宫颈部位的妇科恶性肿瘤，其发病率仅次于乳腺癌，严重威胁全球女性健康和生命安全［1-3］。目前，研究表明宫颈癌与高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染相关，其中与HPV16型和 18 型的相关率达 70%［4-6］。已发现 Caski 细胞包含高危型 HPV16 病毒［7］，因此，针对 Caski 细胞的研究，对探讨宫颈癌治疗新途径具有重要意义。清解扶正颗粒（Qingjie Fuzheng Granules，QFG）由福建中医药大学附属人民医院肿瘤科协定方（清解扶正方）改剂研制而成，组成为白花蛇舌草、半枝莲、炙黄芪、炒麦芽，具有清热解毒、扶正益气的功效。本课题组前期预实验发现QFG 对Caski 细胞活力及生长具有明显的抑制作用，但QFG 对宫颈癌的作用及其可能机制至今尚未有报道。因此本研究通过建立人宫颈癌Caski 细胞裸鼠皮下移植瘤模型，探讨QFG 对人宫颈癌Caski 细胞移植瘤生长的抑制作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 实验药物和配制方法 QFG 由福建中医药大学药学院制剂室提供，动物实验时称取QFG 粉末200 mg 于离心管内，加1 mL 生理盐水进行溶解，配制浓度为200 mg/mL QFG 溶液。

1.2 实验动物及细胞 4周龄SPF 级雄性BALB/c裸鼠12只，体质量18～20 g，由上海斯莱克实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK（沪）2014-0017，饲养于福建中医药大学SPF 级动物实验室，许可证号：SYXK（闽）2009-0001；宫颈癌Caski 细胞株购于北京北纳创联生物科技有限公司。

1.3 试剂与仪器 DMEM 培养基、胎牛血清、磷酸盐缓冲液（PBS，美国Life Technologies 公司）；细胞凋亡TUNEL 检测试剂盒（中国凯基生物技术有限公司）；B 淋巴细胞瘤-2 蛋白（Bcl-2）、B 淋巴细胞瘤-2 基因相关 X 蛋白（Bax）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）抗体均购自武汉三鹰生物技术有限公司；磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）、磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗体均购自美国CST 公司；CO2培养箱、多功能酶标仪均购自美国Thermo公司；超净工作台（苏州净化设备有限公司）；全自动细胞计数仪（美国Life Technologies 公司；荧光显微镜、倒置显微镜系统（德国Leica 公司）。

1.4 方法

1.4.1 细胞培养和宫颈癌Caski 移植瘤模型建立 Caski 细胞株培养于含有10%FBS、1%双抗（含100 U/mL 青霉素和 100 µg/mL 链霉素）的 DMEM完全培养基中，于37℃、5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱内培养。细胞贴壁生长，取对数生长期细胞制备细胞悬液（密度为5.0×107个/mL），皮下接种于12只BALB/c 裸鼠右前肢腋窝处（200 µL/只）。接种4～5 d 后，当裸鼠右侧腋窝下生成绿豆大小移植瘤，即可判定模型建立成功。

1.4.2 动物分组和给药方法 待瘤体生长至大于70～100 mm3后，根据瘤体体积的大小随机将12只裸鼠分为对照组和QFG组，每组各6只，分组当天立即给药。QFG组：依据临床等效剂量换算，按5 mL/（kg·d）灌服 200 mg/mL QFG 溶液。对照组：每只裸鼠灌服与QFG组等剂量的生理盐水。2组裸鼠1周连续给药 6 d，每天1次，共给药6周。

1.4.3 检测瘤体体积、体质量 给药期间每2 d 用游标卡尺测量裸鼠瘤体的长（L）及宽（W），计算瘤体体积；同时，用电子天秤称量每只裸鼠的体质量。瘤体体积计算公式：

瘤体体积＝π/6×L×W2

1.4.4 称取瘤重、计算抑瘤率及采集相关标本 停药24 h 后对裸鼠脱颈处死，剥离瘤组织，观察瘤体有无脏器转移，称取瘤重，计算抑瘤率，并随机选取3 个瘤体进行拍照。将每个瘤体切分成2 份，1 份装于1.5 mL 离心管内暂放冰上，后续用于提取蛋白，进行Western blot 检测；另1 份装于含有4%多聚甲醛溶液的离心管内进行固定，后续用于TUNEL 染色。抑瘤率计算公式为：

抑瘤率＝［1－（治疗组瘤重/对照组瘤重）］×100%

1.4.5 TUNEL 法检测瘤体组织细胞凋亡 将剥离的肿瘤组织包埋、速冻后立即进行冰冻切片（厚度4 µm），切片经二甲苯、酒精脱蜡至水；用PBS 缓冲液冲洗（5 min×3次），再滴加1% Triton X-100 通透液于室温下放置5 min；用TUNEL 免疫荧光试剂漂染肿瘤石蜡标本切片，37℃避光孵育1 h，PBS 漂洗切片2次；加入DAPI 染料于避光的环境中室温孵育15 min，PBS 漂洗3次；滴加适量抗荧光猝灭剂，盖玻片封片，在避光的环境中将切片于电子荧光显微镜下观察，其中荧光绿色为阳性细胞，荧光蓝色为区域总细胞，计算瘤体组织细胞凋亡率，凋亡率计算公式为：

凋亡率＝阳性细胞数/区域总细胞数×100%

1.4.6 Western blot检测瘤体组织蛋白表达水平 采用匀浆法对瘤体组织蛋白进行提取，采用二喹啉酸（bicinchoninic acid，BCA）法检测蛋白量。蛋白液体中加入适量上样缓冲液在100℃金属浴中进行热变性，完成蛋白制备；每份取50 µg 依次进行蛋白样品上样，于聚丙烯酰胺凝胶中电泳后进行转膜，用5%脱脂奶粉对目的膜进行封闭1 h；然后于含有0.25% Tween-20 的 TBST 中漂洗 15 min（5 min/次，共3次），最后孵育目的一抗（GAPDH、Bax、Bcl-2、PI3K、AKT、p-AKT；一抗稀释比例为1/1 000）4℃摇床过夜。次日，孵育相对应的二抗1 h（稀释倍数1/5 000），最后滴加显影液，Bio-Rad 成像系统对蛋白条带进行成像，用Image J 软件对蛋白灰度值进行数据分析。以Bax 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、Bcl-2 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值分别得出Bax 和Bcl-2 相对蛋白表达量，以p-AKT 蛋白灰度值/GAPDH 蛋白灰度值、AKT 蛋白灰度值/GAP‑DH 蛋白灰度值分别得出p-AKT 和AKT 相对蛋白表达量，最后计算Bax/Bcl-2、p-AKT/AKT 比值：

Bax/Bcl-2＝Bax 相对蛋白表达量/Bcl-2 相对蛋白表达量

p-AKT/AKT＝p-AKT 相对蛋白表达量/AKT 相对蛋白表达量

1.5 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件进行数据处理。计量资料服从正态分布以（）表示，采用两独立样本t检验；不符合正态分布采用秩和检验。

2 结 果

2.1 2组裸鼠体质量比较 与对照组比较，QFG组裸鼠体质量无明显变化（P＞0.05），见图1。

图1 2组裸鼠体质量比较

2.2 2组裸鼠瘤体体积比较 见图2。对照组瘤体生长快速，瘤体生长曲线波动幅度大；而QFG组裸鼠前3周瘤体体积与对照组并无明显差异（P＞0.05），后3周瘤体体积波动幅度小，与对照组比较有显著差异（P＜0.05）。同时，从图2B 也可看出QFG组瘤体体积，相较于对照组明显减小。

图2 2组裸鼠瘤体体积比较

2.3 2组裸鼠瘤重量及抑瘤率比较 见表1。

表1 2组裸鼠瘤重量、抑瘤率比较（）

表1 2组裸鼠瘤重量、抑瘤率比较（）

注：与对照组比较，1）P＜0.01。

抑瘤率/%0.00±0.00 79.72±0.151）组别对照组QFG组例数6 6瘤重量/g 0.59±0.12 0.12±0.041）

2.4 2组裸鼠瘤体组织细胞凋亡情况比较 见图3。图 3 显示：对照组凋亡率为（5.24±0.57）%，QFG组凋亡率为（13.6±2.08）%，QFG组细胞凋亡率明显增多（P＜0.05）。

图3 2组裸鼠瘤体组织细胞凋亡情况比较（×200）

2.5 2组裸鼠瘤体组织Bax、Bcl-2 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比较 见图4。图4 显示：与对照组比较，QFG组 Bax 蛋白表达水平增加，Bcl-2 蛋白表达水平降低，Bax/Bcl-2 明显增高（P均＜0.05）。

图4 2组裸鼠瘤体组织Bax、Bcl-2 蛋白表达水平及Bax/Bcl-2 比较

2.6 2组裸鼠瘤体组织 PI3K、AKT、p-AKT 蛋白表达水平及p-AKT/AKT 比较 见图5。图5 显示：与对照组比较，QFG组PI3K、p-AKT 蛋白表达水平明显降低（P均＜0.05），AKT 蛋白表达水平无明显差别（P＞0.05），但p-AKT/AKT 降低（P＜0.05）。

图5 2组裸鼠瘤体组织PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平及p-AKT/AKT 比较

3 讨 论

宫颈癌属中医“崩漏”“瘕聚”范畴。主要由脏腑气血失调，湿毒侵积于下，冲任二脉受损而成。治疗本病以扶正祛邪、消疒征散结为原则。中药复方QFG组方中白花蛇舌草、半枝莲对宫颈癌等多种恶性肿瘤具有良好的抑制作用［8-11］，可通过多成分、多靶点、多通路参与宫颈癌细胞凋亡［12］；炙黄芪、炒麦芽益气健脾，可缓解患者长期放化疗产生的毒副作用，提高宫颈癌患者自身免疫力［13］。前期预实验也发现QFG 可抑制宫颈癌Caski 细胞活力及生长，但QFG 对宫颈癌的作用及其机制，还有待进一步研究。

本研究结果显示：QFG 对人宫颈癌Caski 细胞移植瘤生长具有明显抑制作用，包括降低瘤体体积、瘤重和增加抑瘤率；同时，QFG 可增加瘤体组织中细胞凋亡率。由此可见QFG 可能通过诱导肿瘤细胞凋亡，进而发挥对宫颈癌Caski 细胞移植瘤生长的抑制作用。

细胞凋亡又称细胞程序性死亡，是由基因主动决定的自动结束生命的过程［14］。在细胞凋亡过程中，Bcl-2 家族扮演重要角色，其通过控制线粒体膜的通透性来调节凋亡激活物如细胞色素C 的释放，从而影响细胞的凋亡。Bax 二聚体可以打开线粒体膜，增加膜通透性；Bcl-2 可以与Bax 形成异聚体，Bcl-2 增加，线粒体膜通透性随之降低；Bax/Bcl-2增加可说明细胞凋亡增加［15］。本研究结果也表明QFG 增加Bax/Bcl-2，说明QFG 可促进细胞凋亡。

PI3K/AKT 信号通路在肿瘤的发生、发展中具有重要作用［16］。已有报道，PI3K/AKT 信号通路对细胞凋亡具有直接或间接的调控作用［17］。直接调控作用表现在活化的AKT 会抑制BAD 磷酸化、促进Bax 的Ser184 位点磷酸化，抑制细胞凋亡；间接调控作用表现在活化的AKT 与MDM2 结合，促使MDM2 的 Ser166 和 Ser186 位点磷酸化，核内泛素连接酶活性上调，导致p53 失活，阻断了p53 促凋亡作用［18］。本研究结果显示：经 QFG 治疗后，PI3K 蛋白表达及p-AKT/AKT 均下调，说明QFG 可能通过调控PI3K/AKT 信号通络，诱导细胞凋亡的发生。

综上所述，QFG 可显著抑制裸鼠宫颈癌Caski细胞移植瘤的生长，促进瘤体组织细胞的凋亡，其机制可能与抑制PI3K/AKT 通路活化，促进Bax/Bcl-2 升高有关。