基于网络药理学探讨黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用机制

王振龙 ，韩育英 ，张秀丽 ，李佳凤 ，沈阿灵 *，彭 军 *

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建 福州 350122；2.福建中医药大学老年病重点实验室，福建 福州 350122；3.闽江师范高等专科学校，福建 福州 350122；4.福建省妇幼保健院，福建福州350001）

乳腺癌是最常见的恶性肿瘤之一，2020年全球新发病例数高达226 万，病死率占所有恶性肿瘤的6.9%，严重威胁人类健康［1］。研究表明乳腺癌致死的最主要原因就是发生耐药及远处转移［2］，可见，防治转移性乳腺癌对提高患者预后和延长生存期有着重要意义，进一步寻找能够有效抑制乳腺癌转移的药物迫在眉睫。

中医药因其具有多成分、多靶点和整体调节的特点，可通过多靶点、多通路产生治疗效果，在临床肿瘤治疗中发挥越来越重要的作用，特别是从天然植物中寻找低毒性、高抗癌活性的化合物单体备受青睐［3］。黄芩苷是一种从传统中药黄芩中分离得到的活性黄酮类化合物，在抗肿瘤等方面有着诸多积极作用，对乳腺癌亦有抑制作用［4-7］，而对于转移性乳腺癌的调控机制仍缺乏系统层面的研究。因此，本研究拟通过网络药理学的方法研究黄芩苷、作用靶点和转移性乳腺癌之间的关系，探讨黄芩苷治疗转移性乳腺癌的潜在靶点及作用机制。

1 方 法

1.1 黄芩苷的成药性检验 以“Baicalin”作为检索词在中药系统药理学平台（TCMSP，https：//tcmspw.com/tcmsp.php）［8］获得黄芩苷的药代动力学（AD‑ME）等数据，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 作为黄芩苷的成药性检验依据［9］，获取黄芩苷化合物的MOL2 文件，用于后续黄芩苷的作用靶点预测。

1.2 黄芩苷的作用靶点预测 将“1.1”获取的黄芩苷的 MOL2 文件导入到Pharmmapper 数据库（http：//lilab.ecust.edu.cn/Pharmmapper/）［10］，选择最大生成的构象（maximum generated conformations）为“1 000”，选择目标（select targets set）设定为人类蛋白质，获取黄芩苷的潜在作用靶点。然后，将获得的潜在作用靶 点导 入 Uniplot 数据 库（https：//www.uniprot.org/）［11］转化成统一的基因名，设置基因来源为人源性，从而获得黄芩苷的作用靶点。

1.3 黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用靶点的获取 以“Metastatic breast cancer”为检索词在Gene‑Cards 数据库（https：//www.genecards.org/）［12］检索相关疾病靶点，以相关性得分（relevance score）≥中位数作为筛选条件获得转移性乳腺癌的的疾病靶点。利用 Venny 2.1.0 的在线工具（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）与黄芩苷的作用靶点相映射，得到黄芩苷与转移性乳腺癌共同靶点，即是黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用靶点。

1.4 共同靶点相互作用网络（PPI 网络）构建与分析 将黄芩苷与转移性乳腺癌共同靶点输入STRING 数据库（https：//cn.string-db.org/）［13］“multi‑ple proteins”检索栏中，物种设置为“homo sapiens”，选择置信度＞0.7，其余的参数保持为默认设置，以获取相互作用关系信息表。将PPI 网络数据导出为“tsv”格式文件，然后将文件导入Cytoscape 软件建立PPI 网络，同时对网络进行拓扑结构分析，以“Degree”“Closeness Centrality”和“Betweenness Cen‑trality”3 个指标均大于中位数作为筛选条件，获取具有拓扑重要性的靶点，定义为黄芩苷治疗转移性乳腺癌的核心靶点［14］。

1.5 GO 和KEGG 富集分析 将共同靶点导入DA‑VID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）［15］进行 GO 和KEGG 富集分析。以P＜0.01、错误发生率（FDR）＜0.01 作为筛选依据，获取黄芩苷治疗转移性乳腺癌的信号通路及生物学过程。并且依据富集基因数从多到少进行排序，筛选出KEGG 富集分析结果中排名前10 的信号通路及GO 富集分析结果中排名前10 的生物学过程。

2 结 果

2.1 黄芩苷的成药性检验 利用TCMSP 数据库获得了黄芩苷（PubChem CID：64982）的药代动力学（ADME）数据，如：黄芩苷的分子量（MW）＝446.39 da、口服生物利用度（OB）＝40.12%、类药性（DL）＝0.75 等，由黄芩苷 MW＜500 da、DL＞0.18、OB＞30%表明黄芩苷与已知药物相似，具有成药性。

2.2 黄芩苷的作用靶点 利用Pharmmapper 数据库导入黄芩苷（Molecule ID：MOL002776）的MOL2文件获取412 个黄芩苷的潜在作用靶点，使用Uniplot 数据库转化成统一的基因名，去除重复项，获得399 个黄芩苷的作用靶点。

2.3 黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用靶点 在GeneCards 数据库共收集获得了转移性乳腺癌的6 377 个相关疾病靶点，经筛选获得3 188 个疾病靶点。将黄芩苷的作用靶点和转移性乳腺癌的疾病靶点分别输入Venny 2.1.0 在线工具分析，得到共同靶点（即是黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用靶点）206 个，并用 Cytoscape 软件作图，见图 1。

图1 黄芩苷治疗转移性乳腺癌的作用靶点

2.4 PPI 网络分析结果 将黄芩苷与转移性乳腺癌共同靶点导入String 数据库中，获得一个206 个节点、1 063 条边的 PPI 网络图，见图 2。PPI 网络分析得到：“Degree”中位数为 9、“Closeness Centrality”中位数为 0.373 966 942 148 76 和“Betweenness Cen‑trality”中位数为 0.002 112 449 542 506 35，经筛选获得具有拓扑重要性靶点（即黄芩苷治疗转移性乳腺癌的核心靶点）62 个，包含丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT1）、磷脂酰肌醇3-激酶（PIK3R1）、靶向调控热休克蛋白90α 编码基因（HSP90AA1）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）、GTP 酶（HRAS）、表皮生长因子受体（EGFR）、促生长因子（IGF1）、雌激素受体α（ESR1）、酪氨酸蛋白激酶（JAK2）、B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）等，见图3。

图2 共同作用靶点互作（PPI）网络图

图3 黄芩苷治疗转移性乳腺癌的核心靶点网络图

2.5 GO 富集分析 运用DAVID 数据库对黄芩苷治疗转移性乳腺癌相关的206 个靶点进行GO 富集分析（P＜0.01），获取209 个基因本体条目，其中生物过程（BP）相关条目134 个，主要涉及信号转导、凋亡过程的负调控、炎症反应、蛋白磷酸化、细胞增殖、细胞迁移、MAPK 级联、血管生成等方面；分子功能（MF）的相关条目51 个，主要涉及蛋白质结合、蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、类固醇激素受体活性、ATP 结合等方面；细胞成分（CC）的相关条目24 个，主要涉及细胞质、细胞外间隙、胞外外泌体等方面。并根据富集基因数由多到少进行排序，筛选出排名前10 名，使用GraphPad prism 制图软件制作可视化柱状图，见图4。

图4 共同靶点的GO 富集分析图

2.6 KEGG 通路分析 运用DAVID 数据库对黄芩苷治疗转移性乳腺癌相关的206 个靶点进行KEGG通路分析（P＜0.01），获得具有显著性的信号通路88 条，并且依据富集基因数从多到少进行排序，排名前10 名的信号通路，见表1。由表1 可知：这些共同靶点主要富集在癌症的途径、PI3K/Akt 信号通路、Ras 信号通路、癌症中的蛋白多糖、Rap1 信号通路、FoxO 信号通路、MAPK 信号通路等信号通路。

3 讨 论

本研究结果显示：黄芩苷可能通过调控癌症的途径、PI3K/Akt 信号通路、Ras 信号通路、癌症中的蛋白多糖、Rap1 信号通路、FoxO 信号通路、MAPK信号通路等发挥对转移性乳腺癌的治疗作用，其中多条均被证实参与乳腺癌的疾病进展［16-17］。拓扑重要性靶点及信号通路主要通过信号转导、蛋白磷酸化、蛋白水解、基因表达、炎症反应及细胞凋亡、增殖、迁移等过程实现对转移性乳腺癌的调控。

PI3K/Akt 信号通路是恶性肿瘤最常见的异常调控通路之一，其功能失调性活化与乳腺癌临床预后不良密切相关［16-17］。PI3K 是生长因子受体超家族信号转导过程中的重要组成部分，激活后的PI3K 可引起下游蛋白磷酸化，促进细胞发生间充质转化和细胞外基质沉积［18］。有研究表明：PI3K/Akt 信号通路磷酸化可促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭［19］，并主要与 Src、PI3K、Akt 蛋白的磷酸化水平密切相关［20］。Akt 亦属 PI3K 的下游直接靶蛋白，参与调控细胞增殖及代谢，促进纤维化相关基因转录和蛋白质合成［21］，可调节下游包括凋亡、细胞周期、细胞增殖等多种生物过程［22］。AKT1 与 HSP90AA1作用密切相关，而HSP90AA1 可影响乳腺癌的生存期长短［23］。血浆的HSP90AA1 可抑制肿瘤细胞增值和转移［24］，在乳腺癌组织中比正常组织的表达明显增高，可用于预测乳腺癌的发生和远处转移风险［25］。另外，Akt 还可通过上皮间质转化（EMT）相关蛋白来促进乳腺癌的侵袭和转移［26］，下调E-钙黏蛋白及上调N-钙黏蛋白，使其获得了不同的间质细胞形态，表现出广泛的细胞骨架重构，可能触发多种细胞因子、生长因子，使细胞的游走能力大大提高，并增强了与周边间质组织的亲和能力，肿瘤细胞进而得以扩散以及转移。因此，本研究预测黄芩苷可作用于这些相互作用密切的靶点PI3K、AKT1、HSP90AA1、SRC，调控信号转导、蛋白磷酸化、细胞增殖、细胞迁移等生物过程，进而抑制乳腺癌细胞的转移。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路参与细胞的增殖、分化、凋亡等细胞生理活动，该通路的关键因子有 Ras、Raf、MEK 和 ERK 蛋白，与多种人类肿瘤的发生、发展密切相关。目前公认的机制是一旦Ras-MAPK/ERK 信号通路活化异常，可导致自身突变激活，被上游信号持续激活，进而激活下游的蛋白，造成血管形成、细胞增殖、凋亡抑制等，最终造成肿瘤的产生与进展。MAPK 信号通路的上游是 Ras/Raf 蛋白，下游包括 p38、c-Jun N 端激酶（JNK）与细胞外信号调节激酶（ERK）等，而在乳腺癌细胞内可检测到ERK 的活性异常增高［27］。ERK属于MAPK 亚家族成员，ERK 信号通路可下调抗凋亡蛋白B 细胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2），上调促凋亡因子、Bax 及p38，进而诱导细胞凋亡，起到抑制癌症的作用［7］。另外，MAPK-mTOR 信号通路中通过调节mTOR、细胞外信号调节激酶ERK1/2 及p38等的表达，促进微管相关蛋白LC3（LC3-Ⅱ）和自噬基因-1（Beclin-1）的表达，可抑制肿瘤细胞的增殖，从而发挥抗肿瘤作用［28］。因此，本研究结果预示黄芩苷可能通过调控MAPK、Bcl-2 等核心作用靶点的表达调控肿瘤细胞的增殖、凋亡，发挥治疗转移性乳腺癌的作用。

目前，转移性乳腺癌病死率高且易复发，特别棘手的一种是三阴性乳腺癌，具体为雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）及人表皮生长因子受体2（HER2）阴性。其中，HER2 是 EGFR 成员之一，研究表明EGFR 具有重要的信号转导作用，可调控PI3K/Akt 信号通路影响乳腺癌细胞的黏附与迁移［29］。EMT 是癌症侵袭和转移进展的关键步骤［30］，TGF-β1 能够诱导 EMT，增强体外乳腺癌细胞侵袭转移能力［31］，TGF-β 诱导的 EMT 又可被抑制活化的p38 促分裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）所阻断。有趣的是，本研究结果显示黄芩苷治疗转移性乳腺癌可能涉及的癌症的途径、MAPK 通路、癌症中的蛋白多糖、FoxO 信号通路均有EGFR、TGF-β 的参与。由此可见，EGFR 与 Akt、MAPK、TGF-β 等靶点之间复杂交互作用，共同调控EMT，进而影响乳腺癌的侵袭和转移。

综上所述，本研究结果表明：黄芩苷可能基于PI3K/Akt 信号通路、Ras 信号通路、MAPK 信号通路等核心信号通路，以及调控HSP90AA1、PIK3R1、Akt、SRC、MAPK、EGFR 和 TGF-β 等重要靶点之间复杂交互作用，从而发挥治疗转移性乳腺癌的作用，具体的分子机制还需进一步探讨或通过实验研究来进一步验证。