参白方中总多糖与总皂苷提取工艺的研究

简凤娇，李孝栋

（福建中医药大学药学院，福建 福州 350122）

据世界卫生组织统计，截至2019年，全球新增癌症病例2 360 万例，以化疗为主的肿瘤治疗过程中，骨髓抑制是最常见的毒副反应，而白细胞减少症是骨髓抑制的突出表现［1-2］。临床上，西医治疗白细胞减少症的方法主要有口服或注射升白药物、成分输血以及胚胎干细胞移植等，短期疗效确切，但常伴有不良反应且费用昂贵［3-4］。中药具有多靶点、长效、毒副作用小的优势，但存在使用周期长、见效慢的缺点，而由有效部位组成的中药制剂可提高中药的治疗效果［5］。本研究中的参白方出自谭支绍教授主编的《药用寄生》，方中取银耳12 g、绞股蓝45 g、黄芪和党参各30 g 用清水共煎煮，长期服用可防治癌症放化疗导致的白细胞减少症［6］。参白方的传统提取工艺虽然简单，但有效成分提取不完全，起效慢。通过前期文献查阅与预实验［7-10］，表明总多糖与总皂苷是参白方的主要有效部位。故本研究先采用水提醇沉的方法提取参白方中银耳、黄芪和党参中的总多糖，再将药渣与绞股蓝合并，先乙醇回流提取后再用水饱和正丁醇萃取获得总皂苷。以总多糖和总皂苷的提取率及含量作为正交优化总多糖和总皂苷的提取工艺的评价指标，为参白方的制剂研究奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV-9600 紫外可见分光光度计（北京瑞利分析仪器有限公司）；AR-2140 十万分之一分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）。

1.2 试药 乙醇（湖南湘易康制药有限公司，批号：100320170322）；香草醛（北京市芳草医药化工研制公司，批号：860718）；人参皂苷Rg1对照品（批号：110703201933，纯度≥98.0%）、D-无水葡萄糖对照品（批号：110833200302，纯度≥98.0%）均购自中国食品药品检定研究院；分析纯冰醋酸（批号：2102191）、正丁醇（批号：1601011）、苯酚（批号：171116）均购自西陇科学股份有限公司；甲醇（批号：20190320）、高氯酸（批号：10076732）、浓硫酸（批号：20201222）均购自国药集团化学试剂有限公司。黄芪、绞股蓝、银耳、党参均购自福州闽侯上街致诚药店，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室黄泽豪副教授鉴定为合格药材，符合2020年版《中华人民共和国药典》规定。

2 方法与结果

2.1 总多糖含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 称取银耳2.0 g、黄芪和党参各 5.0 g，浸泡 30 min，加入 25 倍水煎煮 3次，每次4 h，过滤，合并滤液，浓缩至含总生药材1 g/mL；加入4 倍量95%乙醇，静置过夜，过滤，滤饼干燥即得总多糖粗品；精密称取总多糖粗品5.06 mg 于50 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即得每1 mL 含0.101 mg 总多糖的供试品溶液，备用。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取D-无水葡萄糖对照品25.13 mg 于25 mL 量瓶中，加蒸馏水溶解，并稀释至刻度，即得每1 mL 含1.005 mg 的D-无水葡萄糖对照品溶液，备用。

2.1.3 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 量瓶中，加入新配的5%苯酚溶液1 mL，摇匀，再加入浓硫酸5 mL，沸水浴加热15 min 后，取出，置冰水浴冷却10 min，用紫外可见分光光度计于490 nm波长处测定吸光度值，随行空白。以对照品浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：y＝8.45x＋7.92×10-2，r＝0.998 3。结果表明：D-无水葡萄糖在0.010 0～0.060 3 mg/mL 浓度范围与吸光度值呈良好的线性关系。

2.1.4 精密度试验 量取同一份对照品溶液，按“2.1.3”项下方法，重复测定吸光度值6次。测得吸光度的平均值为0.450，RSD为0.86%，结果表明该仪器精密度良好。

2.1.5 重复性考察 分别制备6 份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法平行测定吸光度值，计算供试品溶液中总多糖平均含量为43.114%，RSD为0.62%，结果表明该方法的重复性良好。

2.1.6 稳定性考察 量取同一份供试品溶液，按“2.1.3”项下方法，分别在0、15、30、45、60、90、120 min时测定吸光度值。测得吸光度平均值为0.431，RSD为1.08%，结果表明供试品溶液在2 h 内稳定。

2.1.7 加样回收率实验 精密量取6 份已知含量的供试品溶液各0.5 mL，分别加入对照品溶液各20 µL，按“2.1.3”项下方法测定吸光度值。结果见表1，表明该方法准确度良好。

表1 加样回收率实验结果

2.2 总皂苷含量测定

2.2.1 供试品溶液的制备 称取绞股蓝7.5 g，合并多糖提取滤渣，加入8倍量由“2.1.1”项下所得醇沉液配制的80%乙醇，浸泡30 min，提取2 h，过滤；滤渣再加入8 倍量80%乙醇，同法提取，合并滤液，浓缩至含总生药材1 g/mL；每次加入3 倍量水饱和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇层，回收正丁醇，干燥即得总皂苷粗品；将所得总皂苷粗品适量溶于25 mL量瓶中，加入蒸馏水稀释至刻度，即得每1 mL 含1 mg 的总皂苷的供试品溶液，备用。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取人参皂苷Rg1对照品10.04 mg 置于25 mL 量瓶中，加入甲醇溶解，稀释至刻度，即得每1 mL 含0.402 mg 的人参皂苷Rg1对照品溶液，备用。

2.2.3 线性关系考察 精密量取对照品溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL 于10 mL 量瓶中，100℃水浴挥干后，冷却，加入新配的5%香草醛溶液0.2 mL，高氯酸溶液0.8 mL，60℃水浴加热15 min，取出，立即用冰水冷却，精密加入冰醋酸5 mL 后，用紫外分光光度计于550 nm 波长下测定吸光度值，随行空白。以对照品浓度（x）为横坐标，吸光度（y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程：y＝1.01×10-2x－1.02×10-2，r＝0.999 1。结果表明：人参皂苷Rg1 在0.016 1～0.064 3 mg/mL 浓度范围内与吸光度值呈良好的线性关系。

2.2.4 精密度试验 量取同一份对照品溶液，按“2.2.3”项下方法，重复测定吸光度值6次。测得吸光度的平均值为0.393，RSD为0.45%，结果表明该仪器精密度良好。

2.2.5 重复性考察 分别制备6 份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法平行测定吸光度值，计算供试品溶液中总皂苷平均含量为33.639%，RSD为0.28%，结果表明该方法的重复性良好。

2.2.6 稳定性考察 量取同一份供试品溶液，按“2.2.3”项下方法，分别于0、15、30、45、60、90、120 min时测定吸光度值。测得吸光度平均值为0.287，RSD为1.06%，结果表明供试品溶液在2 h 内稳定。

2.2.7 加样回收率实验 精密量取6 份已知含量的供试品溶液各1.5 mL，分别加入人参皂苷Rg1对照品溶液各0.1 mL，按“2.2.3”项下方法测定吸光度值。结果见表2，表明该方法准确度良好。

表2 加样回收率实验结果

2.3 正交优化试验

2.3.1 总多糖提取的正交试验 参考相关文献与预实验结果，选取提取时间（A）、提取次数（B）、料液比（C）为考察因素，平行操作条件下，以总多糖的提取率与含量为评价指标，按L9（34）正交表设计实验，见表3。分别称取9 份银耳2.0 g，党参、黄芪各5.0 g，根据正交因素水平表，按“2.1.1”项下方法提取得总多糖粗品。精密量取0.1 mg/mL 总多糖溶液1 mL，按“2.1.3”项下方法，测定总多糖的吸光度值，并计算总多糖含量。结果见表4～表5。

表3 总多糖提取的正交试验因素水平表

表4 总多糖提取的正交试验结果

表5 总多糖提取的正交试验方差分析表

由表5 方差分析可知：提取时间、提取次数、料液比对总多糖含量影响均不显著（P＞0.05），选择的3 个因素对实验结果的影响，由大到小为A＞B＞C，总多糖的优选提取工艺条件为A3B3C2，即料液比为1∶20，提取3次，每次4 h，合并滤液，浓缩至含总生药材1 g/mL，加入4 倍量95%乙醇，静置过夜，过滤，滤饼干燥即得总多糖粗品。

2.3.2 总皂苷提取的正交试验 根据相关资料与预实验结果，选取提取时间（A）、提取次数（B）、乙醇浓度（C）、料液比（D）为考察因素，平行操作条件下，以总皂苷的提取率与含量为评价指标，按L9（34）正交表设计实验，见表6。分别称取9份绞股蓝7.5 g，根据正交因素水平表，按“2.2.1”项下方法提取得总皂苷粗品。精密量取1 mg/mL 总皂苷溶液1 mL，按“2.2.3”项下方法，测定吸光度值并计算总皂苷含量。结果见表7～表8。由方差分析可知：提取时间、提取次数、乙醇浓度、料液比对总皂苷含量影响均不显著（P＞0.05），选择的4个因素对实验结果的影响，由大到小为B＞C＞D＞A，总皂苷的最佳提取工艺条件为A3B2C2D1，即料液比为1∶8，用80%乙醇加热回流提取2次，每次2 h，合并滤液，浓缩至含总生药材1 g/mL，每次加入3 倍量水饱和正丁醇，共萃取3次，取正丁醇层，回收正丁醇，干燥即得总皂苷粗品。

表6 总皂苷提取的正交试验因素水平表

表7 总皂苷提取的正交试验结果

表8 总皂苷提取的正交试验方差分析表

2.4 工艺验证 分别称取3 份与正交试验相同批次的各个药材，分别按“2.3.1 ”与“2.3.2 ”项下方法提取总多糖粗品与总皂苷粗品，并计算其提取率与含量。结果见表9～表10。

表9 总多糖最优提取工艺验证结果

表10 总皂苷最优提取工艺验证结果

所得结果与正交试验结果最大值比较，相差不大，由此可判断，优选的工艺可行、稳定。

3 讨 论

中药具有多成分、多靶点、多途径的特点，但因其成分众多、复杂，也造成了中药制剂服用量大，起效慢，故分离纯化中药有效成分或部位，减量增效是中药现代化开发的有效思路之一。通过文献的查阅，对参白方中各药味有效部位的分析，结合前期药效预实验，表明参白方中总多糖和总皂苷具有升高白细胞水平的作用，故本实验对参白方中总多糖和总皂苷的提取进行工艺优化研究。传统中药复方的提取液中成分众多，给有效成分的分离纯化带来诸多不便。而本实验在提取阶段便分离出所需的有效部位粗品，为后期进一步纯化处理奠定基础。

参白方中提取的总多糖为粗多糖，硫酸能够将多糖先水解为单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，并与苯酚生成橙黄色化合物，采用硫酸-苯酚法能够准确测定总多糖的含量，同时可以避免粗总多糖中蛋白的影响，且显色较为稳定［11］。结合文献以及2020 版《中华人民共和国药典》对多糖的含量测定，以D-无水葡萄糖作为指标成分。参白方中提取的总皂苷主要以绞股蓝皂苷为主，而人参皂苷Rg1是绞股蓝皂苷中具有升高白细胞水平作用的主要成分之一［12］，故以人参皂苷Rg1为总皂苷含量测定的指标成分。

总多糖与总皂苷提取的正交试验设计以含量和提取率为评分指标，通过查阅文献，设计综合评分权重为含量占比70%，提取率占比30%。主要考虑到本实验提取的总多糖和总皂苷为粗品，其含量能反映该提取工艺对后期分离纯化的影响；同时以提取率作为辅助指标，能全面反映提取工艺的优劣。在前期的单因素实验中，分别考察了提取时间（1、2、3、4、5 h）、提取次数（1、2、3、4、5次）和料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30）对银耳、黄芪和党参中总多糖提取的影响，结果表明：随着提取时间、提取次数和料液比的增加，总多糖的得率及含量逐渐增加，分别在提取4 h、提取3次和料液比为1∶25 时达到峰值，而提取 3 h 和 5 h 对总多糖提取的影响相当，考虑时间成本，设计正交试验优化的因素和水平。同样，分别考察了提取时间（1、2、3、4、5 h）、提取次数（1、2、3、4、5次）、料液比（1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14）和乙醇浓度（50%、60%、70%、80%、90%）对参白方中总皂苷回流提取的影响，结果表明：分别在提取2次和料液比为1∶10 之后，总皂苷的提取率在逐渐下降，而提取2 h 和乙醇浓度为80%时，最有利于总皂苷的提取，故设计正交试验优化总皂苷提取的因素和水平。

总皂苷提取工艺优化结果表明：回流提取次数对总皂苷的提取影响较大，提取时间与料液比影响较小，如果考虑到节约试剂和时间成本，可以适当调整提取时间和料液比。从本次正交试验中可以发现：总多糖的提取率达到15%，总皂苷提取率可达12%，含量为30%～50%，可根据需要考虑是否进一步纯化，以提高总多糖与总皂苷的含量。本实验对参白方中多个有效部位提取工艺的优化能为中药复方的提取工艺提供有益启示，也为中药制剂的进一步开发奠定基础。