丹瓜方调节糖脂代谢紊乱大鼠氨基酸代谢研究

衡先培，王志塔，李 亮，黄苏萍，杨柳清

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建 福州 350004；2.福建中医药大学，福建 福州 350122）

糖尿病不仅是糖脂代谢病，也是氨基酸代谢病，无论糖尿病的发病、进展及预后，都与氨基酸代谢密切相关［1-2］。氨基酸代谢不但与糖脂代谢密切相关，也与基因和蛋白质代谢密不可分。由于氨基酸是蛋白质的基础，蛋白质是构建人体组织器官、维护器官功能的基本要素，对人体生理、病理具有关键的影响，氨基酸代谢异常可导致患者生活质量与健康显著下降。化学药物强化治疗虽能有效改善血糖、血脂、血压等客观指标，但不能改善氨基酸代谢，甚至存在恶化氨基酸代谢的风险［3］。临床研究表明，痰瘀同治丹瓜方可改善糖尿病患者的糖脂代谢，降低高危糖尿病患者冠心病发病和全因不良风险，同时也提高患者生活质量［4］。由于氨基酸代谢与蛋白质代谢之间存在着密切关系，提示痰瘀同治法的疗效可能与改善氨基酸代谢有关。因此，本研究基于蛋白质及磷酸化代谢组学，探讨丹瓜方对氨基酸代谢的影响。

1 实验材料

1.1 实验动物 7周龄SPF级雄性SD大鼠，体质量（311±11）g，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证编号：SCXK（沪）2017-0005。饲养环境：温度（22±1）℃，湿度（50±5）%，自由摄食。动物实验遵守伦理原则，符合国家及相关部门有关实验动物保护与使用准则，善待动物。

1.2 实验药物 丹瓜方（国家发明专利号：2014 10599300.6）由丹参、栝蒌、赤芍、法半夏、僵蚕、薤白组成。

1.3 实验试剂 链脲佐菌素（STZ）、碘代乙酰胺、二硫苏糖醇、尿素、三乙基碳酸氢铵（美国Sigma公司）；蛋白酶抑制剂（Calbiochem公司）；胰酶（Promega公司）；乙腈（Fisher Chemical公司）；超纯水、三氟乙酸（Sigma-Aldrich公司）；甲酸（Fluka公司）；EDTA、Ethidium Bromide、MOPS（华 美 生 物 工 程公司）。

1.4 实验仪器 小型垂直电泳槽、电泳仪、IMARK酶标仪（美国Bio-Rad公司）；300 Extend C18色谱柱（美国Agilent公司）；分析柱和Acclaim™PepMap™100 C18液相色谱柱（164568）、SpeedVac浓缩器、Heraeus Multifuge X1R台式高速冷冻离心机（美国ThermoFisher Scientific公司）；JY92-ⅡN高强度超声波处理器（宁波新芝生物科技股份有限公司）；High pH reverse-phase HPLC（L3000）（中国RIGOL Technologies）；TS-200脱色摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；DK-8D型电热恒温水槽（上海森信实验仪器有限公司）；Velocity 18R台式冷冻离心机（英国Dynamica公司）；timsTOF Pro质谱仪（德国Bruker公司）；CR2032微量血糖测试仪（德国BAYER公司）；光学显微镜（德国Leica公司）。

2 实验方法

2.1 造模与分组 SD大鼠适应性饲养1周后进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），选取空腹血糖（FBG）＜6.1 mmol/L、2小时血糖（2 h PBG）＜7.8 mmol/L的大鼠。以空腹体质量分层，按PBG由高到低，以1∶2随机分为对照组和造模组。对照组饲以普通饲料，造模组饲以高脂高糖饲料（配方：精炼猪油10%，胆固醇2%，猪胆盐0.3%，蔗糖20%，常规饲料67.7%）。4周后，造模组再做OGTT，以空腹体质量分层，按PBG由高到低，以1∶1随机分为模型组和丹瓜方组。丹瓜方组按20.5 g/（kg·d）以丹瓜方灌胃液灌胃，模型组用清洁自来水灌胃，每日1次。3组均继续喂食各自原有饲料。根据既往实验，用药物干预10周后，禁食但不禁水12 h取标本。根据体质量与血糖，每组随机取6只大鼠采血和取肝组织，用于本研究的指标测定。

2.2 口服葡萄糖负荷试验 大鼠禁食不禁水8～10 h后，鼠尾尖取血，用微量血糖仪测FBG后，按葡萄糖2 g/kg以50%的葡萄糖注射液灌胃并记录灌胃时间，2 h后再次测2 h PBG。

2.3 生化检测 采用常规生化法检测血浆胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）。

2.4 肝组织染色 分别采用HE染色、油红O脂肪染色和Masson染色观察各组大鼠肝组织。HE染色：组织洗涤，石蜡包埋，切片，脱蜡，苏木素浸染，1%盐酸酒精分蓝，自来水浸泡返蓝，伊红浸染，浸洗，树脂封片。Masson染色：石蜡切片，脱蜡，切片铬化处理，自来水浸洗至黄色消失后，再用蒸馏水滴注洗涤，加入Regaud苏木精染液，充分水洗，加入Masson丽春红酸性复红液，洗涤，1%磷钼酸水溶液分化，苯胺蓝染色，0.2%冰醋酸水溶液浸洗，脱水透明，中性树胶封片。油红O染色：冰冻切片，厚度10μm，70%乙醇固定，蒸馏水洗涤，油红稀释液染，避光，密封，加入60%乙醇，蒸馏水洗涤，苏木素复染，蒸馏水洗涤，甘油明胶封片。

2.5 LC-MS/MS分析 取每只大鼠的肝标本50 mg，将同一组的2个标本放入研磨器中用液氮研磨。每组的3个样品含有6个大鼠的肝组织样本，用于蛋白质提取和磷酸化修饰的非标记定量组学分析。胰蛋白酶消化后，根据商家提供的说明书进行机上检测。技术路线：蛋白质提取→胰蛋白酶消化→亲和富集→LC-MS/MS分析→数据库搜索→生物信息学分析。亚细胞定位用Wolfpsort库（v.0.2，http：//www.genscript.com/psort/wolf_psort.html），富集分析用Perl module库（v.1.31，https：//metacpan.org/pod/Text：：NSP：：Measures：：2D：：Fisher），GO注释用InterProScan库（v.5.14-53.0，http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）。

2.6 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据处理。计量资料属正态分布者用（±s）表示，多样本两两比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 3组大鼠血糖、血脂指标比较 模型组2 h PBG、TG和TC均明显高于对照组（P＜0.01）；丹瓜方组2 h PBG、TG、TC均明显低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），见表1。

表1 3组大鼠血糖、血脂指标比较（±s） mmol/L

表1 3组大鼠血糖、血脂指标比较（±s） mmol/L

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

TC 2.35±0.32 5.99±0.681）5.06±0.413）组别对照组模型组丹瓜方组n6 6 6 FBG 6.05±0.30 6.26±0.43 6.06±0.56 2 h PBG 6.58±0.43 8.00±0.801）7.38±0.192）TG 1.07±0.22 1.80±0.201）1.49±0.192）

3.2 3组大鼠肝组织病理形态 正常组肝脏呈暗褐色，肝细胞结构正常，胞核分布均匀，仅在汇管区有少量蓝色纤维组织染色和细粒状脂肪染色。模型组肝脏呈嫩白色，肝细胞空泡状且分布不均，胞核边移，蓝色纤维组织呈网状，红色大脂滴满布。丹瓜方组肝脏呈褐红色，肝细胞结构清楚，胞核分布均匀，汇管区呈蟹足样纤维染色，中小脂滴较多。见图1。

图1 3组大鼠肝组织病理形态图

3.3 丹瓜方对差异表达蛋白亚细胞结构定位的影响 如图2A所示，模型组与对照组的差异表达显著性蛋白涉及细胞质、线粒体、细胞核、质膜及内质网等。如图2B所示，丹瓜方组与模型组的差异表达蛋白出现在细胞核、细胞质，尤其是线粒体和质膜。这些膜结构及其功能，都与氨基酸与蛋白质代谢密切相关。此外，丹瓜方组还能影响细胞骨架蛋白（cytoskeleton）的表达。由于蛋白质由氨基酸构成，表明丹瓜方可能影响糖脂代谢异常大鼠的氨基酸代谢，并可能由此改善蛋白质代谢。

图2 LC-MS/MS分析亚细胞定位饼图

3.4 丹瓜方对生物学进程的影响 如图3A所示，丹瓜方不但可显著影响肝组织甘油脂生物合成过程（glycerolipid biosynthetic process）、磷脂生物合成过程（phospholipid biosynthetic process）、甘油磷脂代谢过程（glycerophospholipid metabolic process）、磷脂代谢过程（phospholipid metabolic process）、甘油脂代谢过程（glycerolipid metabolic process）等糖脂的代谢进程，而且也能调节包括细胞生长（regulation of cell growth）、细胞形态发生（regulation of cell morphogenesis）、心脏发育（heart development）、超分子纤维组织（regulation of supramolecular fiber organization）、骨骼发育（bone development）等。尤其是正调控细胞发育（positive regulation of cell development）、促进蛋白质寡聚化（protein oligomerization）和正调控转移酶活性（positive regulation of transferase activity），都表明丹瓜方能加强蛋白质的功能，促进细胞发展，这些都离不开充分合理的氨基酸代谢，进一步提示丹瓜方可能通过改善氨基酸代谢，以改善蛋白质代谢及细胞功能。在图3B的磷酸化组学中，丹瓜方显著调控组织再生（tissue regeneration）、肽转运（peptide transport）、酰胺转运（amide transport），都与氨基酸代谢密切关联，表明此观点与事实相符。

图3 生物学进程功能富集图

3.5 丹瓜方对氨基酸代谢调控分析 从表2的COG功能条目中可以看出，涉及能量产生与转化、碳水化合物的运输与代谢、核苷酸转运与代谢、酶转运与代谢、脂肪转运与代谢、无机离子转运与代谢、次生代谢物的生物合成、转运和分解代谢以及氨基酸的转运与代谢，模型组都有多个功能蛋白发生显著性差异表达和差异磷酸化。经过丹瓜方干预后，其中大部分条目都有不同数量功能蛋白对模型组发生差异化表达。其中涉及氨基酸转运与代谢的差异表达蛋白有4个（D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904），差异磷酸化蛋白有2个（P10860、D4A904），见表3。

表2 COG分类功能条目在丹瓜方干预后的差异表达蛋白个数

表3 氨基酸转运与代谢差显调节蛋白

4 讨论

氨基酸是蛋白质的基本构成单位，蛋白质是生命活动的基本要素。人体组织器官的基本构架都以蛋白质为主体，人体的功能活动本质上是蛋白质功能的宏观体现。糖尿病患者氨基酸代谢异常，必然伴随着不同程度的组织蛋白质合成障碍，同时也导致功能蛋白质的异常。这些功能蛋白质包括各种酶、激素、抗体与受体、神经递质等，调控人体的各种功能及代谢，是影响患者生活质量的关键因素。

大量研究表明，糖尿病伴随氨基酸代谢异常，并且是影响糖尿病心血管事件及全因终点的独立危险因素［2］。研究表明，2型糖尿病患者尿氨基酸排泄水平显著升高，其中尿苯丙氨酸、精氨酸、色氨酸、酪氨酸和半胱氨酸的排泄显著高于健康对照［5］。临床研究发现，2型糖尿病患者循环血液中的γ-氨基丁酸（GABA）（可由谷氨酸转化而来）、精氨酸、谷氨酰胺和磷酸乙醇胺浓度显著降低，而缬氨酸水平高于对照组。IGT组GABA水平降低，酪氨酸浓度升高。血浆必需氨基酸水平与空腹及激发后血糖、空腹C肽、HOMA胰岛素抵抗、空腹胰高血糖素水平呈正相关［6］。2型糖尿病患者标准餐后150 min外周血中丝氨酸、鸟氨酸水平显著低于健康对照组，而苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸水平高于正常对照组［7］。

在2019年，有研究者对475例2型糖尿病患者进行了为期6年的队列研究，发现甘氨酸水平位于最高分位的人群，5年新发为糖尿病的风险比最低分位的人群降低了76%。支链氨基酸、芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸）水平较高的研究对象5年新发糖尿病的风险明显较高，而甘氨酸水平较高的研究对象5年新发糖尿病的风险明显较低［1］。另一项临床研究结果也显示，血浆多种氨基酸水平的变化与糖尿病发病风险相关［8］。因此，调节氨基酸代谢，对于防治糖尿病及提高糖尿病的治疗效果，是关键的一环。

本研究从系统生物学角度，利用组学技术研究了中药复方制剂丹瓜方对糖脂代谢紊乱模型氨基酸代谢的影响。基于表3分析可以看出，D3ZPY2蛋白的基因是Hsd3b7，主要涉及代谢途径包括胆汁酸和胆盐的合成与代谢，在肝脏生物化学与生物物理两大屏障方面与氨基酸代谢密切相关，同时还与氨基酸交换和相关酶活性有关［9］。国外在肥胖儿童中发现参与脂质与氨基酸代谢的基因CES1、NPRR3和BHMT2发生显著性差异表达［10］。Q68FT5蛋白的基因是Bhmt2，即甜菜碱-高半胱氨酸S-甲基转移酶，主要影响含硫氨酸（包括结构氨基酸蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸和非结构氨基酸高半胱氨酸），促进这些氨基酸的合成或转化［11］。D4A904蛋白的基因是Nags，催化谷氨酸与乙酰辅酶A进行乙酰化反应生成N-乙酰谷氨酸的酶。N-乙酰谷氨酸（N-acetyl glutamic acid，NAG）是精氨酸内源合成途径的第一个合成酶，即氨基甲酰磷酸合成酶I（carbamyl phosphate synthase I，CPSI）的变构激活剂［1］，还可催化氨甲酰磷酸合成酶以调节氨基酸代谢的最后环节，即尿素循环。

P10860蛋白的基因是Glud1或GDH1，即谷氨酸脱氢酶1，是一种线粒体酶，催化氨还原性固定到α-酮戊二酸上，形成谷氨酸（α-酮戊二酸＋NH3＋NADH+＋H+→谷氨酸＋NAD+）。此外，GDH1还调节缬氨酸、氨基丁酸、亮氨酸代谢。在慢性疲劳综合征中，发现谷氨酸/谷氨酰胺、支链氨基酸和一些必需氨基酸都显著下调［12］。表2示，丹瓜方不但显著恢复性上调GDH1的表达，还显著上调其磷酸化水平，上调其功能，可以促进更多的糖脂代谢中间产物转化为谷氨酸。在组学数据中还发现，与谷氨酸代谢或转化相关的多种酶蛋白都有上调，包括谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（glutamatecysteine ligase catalytic subunit）、蛋白质谷氨酸O-甲基转移酶（protein-glutamate O-methyltransferase）、谷氨酸-半胱氨酸调节亚基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、线粒体谷氨酸载体1样蛋白（A0A0G2K5L2）、富含谷氨酸的WD重复序列蛋白1（基因为Grwd1）、D-谷氨酸环化酶（D-glutamate cyclase）、谷氨酸受体2（glutamate receptor 2）、叶酰聚谷氨酸合酶（folylpolyglutamate synthase）；谷氨酸代谢磷酸化上调蛋白包括谷氨酸-半胱氨酸调节亚基（glutamate-cysteine regulatory subunit）、精氨酸-谷氨酸富集蛋白（arginine and glutamate-rich protein 1）。这表明，丹瓜方可显著上调谷氨酸的代谢。由于谷氨酸是各种氨基酸代谢或转化的枢纽和中间环节，通过谷氨酸代谢的上调，进而可影响其他多种氨基酸的代谢。

研究结果显示，丹瓜方干预糖脂代谢异常，可直接调节蛋氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、高半胱氨酸、精氨酸、N-乙酰谷氨酸、氨甲酰磷酸、谷氨酸的合成，尤其是通过多途径上调谷氨酸的合成，并通过调节胆汁酸代谢和尿素循环，最终影响各种氨基酸的代谢，其机制与调节D3ZPY2、Q68FT5、P10860、D4A904蛋白表达及P10860、D4A904蛋白的磷酸化有关。综上，痰瘀同治丹瓜方显著改善糖脂代谢紊乱模型的氨基酸代谢，这一作用有助于理解丹瓜方显著改善糖尿病患者生活质量和预后的机制。