捏脊按摩对大鼠缺血缺氧性脑病的干预作用及机制研究

黄惠榕，余真铃，缪少芳，薛佳璐，余梦霞，吴翠娟，仇志琴

（1.福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004；2.福建中医药大学护理学院，福建福州 350122）

新生儿缺血缺氧性脑病（hypoxic ischemic encephalopathy，HIE）是指围生期因缺氧和脑血流减少或暂停所致的脑组织缺氧缺血性损害，严重可导致新生儿死亡或造成智能低下、癫痫、共济失调等不可逆脑损害，给家庭和社会带来严重负担［1］。据估计，HIE的发病率约为活产儿的1‰～8‰，10%～60%的患儿发生死亡，至少25%的存活婴儿有长期的神经发育后遗症［2］。HIE新生儿存在一定程度缺氧及酸中毒，可引起血管内皮细胞受损肿胀及组织器官损伤，激活凝血系统，形成血液高凝状态，继而形成微血栓，导致脑微循环障碍，进一步加重脑细胞缺血缺氧，如此恶性循环［3］。组织因子（tissue factor，TF）和组织因子途径抑制物（tissue factor pathway inhibitor，TFPI）是血管内皮损伤时由血管内皮细胞高度表达分泌的凝血和抗凝物质［4］，两者之间的相互作用可以调节人体血栓形成［5］。研究表明，捏脊按摩可能通过增加脑血流量，提高脑部营养供应，从而促进HIE幼鼠体格发育，改善早期神经行为［6］。而捏脊按摩治疗HIE的作用机制是否与调节体内TF、TFPI表达水平相关，目前尚无相关报道。因此，本研究通过建立HIE大鼠模型，从血液微循环的角度探讨捏脊按摩对HIE大鼠的作用机制，为捏脊按摩治疗HIE提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 选取42日龄健康清洁级SD大鼠100只，体质量（190±20）g，雌雄各半，由福建中医药大学实验动物中心代购并饲养，使用许可证号：SYXK（闽）2020-0002。饲养条件为屏障环境，室温22～26℃，光照控制12 h，自由采食饮水。实验过程对动物的处置符合中华人民共和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》［7］。

1.2 实验药物 单唾液酸四己糖神经节苷脂（GM1，西南药业股份有限公司），用0.9%氯化钠溶液稀释成浓度为1 mg/mL的GM1溶液。

1.3 实验试剂 高纯氮气（华新达气体）；戊巴比妥钠（上海安谱科学仪器有限公司）；4%多聚甲醛（南通市卫宁实验器材有限公司）；石蜡（上海艾研生物科技有限公司）；中性树胶（上海钰博生物科技有限公司）；苏木素、伊红（珠海贝索生物技术有限公司）；磷酸盐缓冲溶液（PBS，广州和为医药科技有限公司）；大鼠TF ELISA试剂盒、大鼠TFPI ELISA试剂盒（上海酶联生物科技有限公司）。

1.4 实验仪器 XBS-03＋恒温缺氧箱（杭州爱普仪器设备有限公司）；TS-92摇床（江苏海门其林贝尔仪器制造有限公司）；DYY-6C恒温箱（北京六一生物科技有限公司）；MM721AAU-PW微波炉（广州美的厨房电器制造有限公司）；M199切片刀（金华市华速科技有限公司）；YD-315石蜡切片机（浙江金华益迪试验器材）；BMJ-A石蜡包埋机（常州市中威电子仪器有限公司）；BCD-245F普通冰箱（合肥荣事达三洋电器股份有限公司）；E-201-C精密pH计（上海仪电科学仪器股份有限公司）；BA210T光学显微镜（麦克奥迪实业集团有限公司）；Aquaplore 2S超纯水仪（美国艾科浦国际有限公司）；Infinite F50多功能酶标分析仪（瑞士Tecan公司）；PW-812全自动酶标洗板机（深圳市汇松科技发展有限公司）；TGL-18M台式高速冷冻离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；LyserPro GS60201程序式冷冻组织破碎仪（莫纳生物科技有限公司）；超低温冰箱（浙江捷盛制冷科技有限公司）；精密电子秤（昆山优科维特电子科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 模型的建立与评估 参照改良Rice-Vannucci法［8-9］建立大鼠缺血缺氧性脑病模型。腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液（0.1 mL/100 g）进行麻醉后取仰卧位，75%酒精消毒后在颈前部做纵行正中切口，分离左侧颈总动脉，用4-0丝线结扎，缝合切口后返回鼠笼恢复2 h，再将大鼠放入37℃恒温缺氧箱中，以1 L/min的速度通入8%的氧气和92%的氮气，2.5 h后取出大鼠，继续保温1 h后作神经行为学测定，翻身不能、平衡异常和左旋者视为造模成功。对造模过程中未苏醒或死亡的动物予以剔除。

2.2 实验分组 将100只SD大鼠按照随机数字表法随机分为治疗组（n＝30）、对照组（n＝30）、模型组（n＝15）、假手术组（n＝10）、正常组（n＝15）。治疗组、对照组、模型组均按照“2.1”项进行造模；假手术组大鼠腹腔注射3%戊巴比妥钠溶液（0.1 mL/100 g）进行麻醉后，切开颈部皮肤，分离左颈总动脉后，即缝合切口；正常组大鼠未予任何手术处理。造模期间治疗组死亡1只、对照组死亡2只、模型组死亡2只，最终治疗组29只，对照组28只，模型组13只，假手术组10只，正常组15只。

2.3 干预方法 各组大鼠均于造模成功后24 h进行干预。对照组大鼠按20 mg/kg予GM1腹腔注射，每日1次。治疗组在对照组干预基础上加用捏脊按摩，大鼠腧穴和经络定位参考《实验针灸学》［10］。捏脊按摩操作方法：用双手的中指、无名指和小指握成半拳状，食指半屈在下，拇指伸直从上对准食指前半段，然后顶住皮肤，拇食指前移，提拿皮肉，随捏随提，双手交替捻动并向前推进，即自尾根部沿脊柱两侧肌肤向上至大椎穴止。捏脊一般以脊柱为中心分3条线，即左右膀胱经和督脉，先捏左膀胱经3次，次捏右膀胱经3次，再捏督脉3次，共计9次。为加强手法感应，通常每条线采用“捏三提一法”，即先捏脊1遍，从第2遍开始，每捏3次，向上提拿1次。捏脊按摩每次20 min，每日1次。模型组、假手术组和正常组大鼠均无干预措施，普通饲养。各组分别于治疗第7、14、21 d后随机抽取若干只大鼠进行取材。

2.4 标本的取材及制备

2.4.1 血清标本采集 每组在不同时间点各取3～10只大鼠，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉后，打开腹腔进行腹主动脉采血4～5 mL，并收集于标记好的采血管中，室温下静置2 h，于2～8℃下以3 124 r/min离心15 min，吸取上清液，-80℃冰箱保存，用于检测血清TF、TFPI水平。

2.4.2 脑组织标本采集

2.4.2.1 石蜡切片标本制备 每组在不同时间点各取1～2只大鼠，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉、腹主动脉采血后，打开胸腔，暴露左心室，用装有0.9%氯化钠溶液的注射器针头迅速刺入左心室尖部，而后在右心耳位置剪开一个小口，用0.9%氯化钠溶液150 mL快速灌流，再用4%多聚甲醛150 mL进行快速灌流，待肝脏逐渐变白、头部和肢体变硬后断头取脑组织。将硬脑膜与脑组织剥离，完整取出脑组织，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h。经视交叉处冠状面切取标本，厚度约0.5 cm，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，轮转式切片机制备成5μm厚度切片，温水中展开，玻璃贴片，做好标记后常温室内保存，用于观察脑组织神经元病理形态学改变。

2.4.2.2 ELISA检测标本制备 每组在不同时间点各取2～8只大鼠，3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉、腹主动脉采血后，沿头颅中线剪开皮肤和颅骨，在冰盘上完整取脑，冰生理盐水漂洗除去血液，滤纸吸干后，矢状离断为左右半球，取左脑置于冻存管中，封盖，立即置于液氮中快速冷冻，随后-80℃冰箱保存，用于检测脑组织TF、TFPI水平。

2.5 观察指标及检测方法

2.5.1 HE染色观察神经元病理形态学改变 每组每个时间点取5张石蜡切片，60℃烤片12 h；二甲苯脱蜡15 min，3次；梯度乙醇脱苯，蒸馏水浸洗5 min；苏木素染色1 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；伊红染0.5 min，蒸馏水冲洗；用梯度乙醇脱水，每级5 min，再用二甲苯充分透明后树胶封片，在400倍显微镜下观察缺血缺氧侧脑组织神经元的形态学变化，光镜下神经元细胞核呈蓝色，细胞浆呈不同程度的红色。

2.5.2 ELISA检测血清TF、TFPI水平 每组每个时间点的血清严格按照ELISA试剂盒的说明书进行操作，酶标仪在450 nm波长下测定吸光度（OD值）。

2.5.3 ELISA检测脑组织TF、TFPI水平 每组每个时间点取冻存脑组织，融化后，准确称取样本重量。低温冷冻破碎，以0.1 mg样本加1 mL预冷PBS重悬，于2～8℃下以12 000 r/min离心15 min，取上清液，ELISA法检测脑组织TF、TFPI的含量，所有操作严格按照试剂盒的说明书进行。

2.6 统计学方法 采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，计量资料符合正态分布以（±s）表示，组间比较若符合正态分布，采用双因素方差分析，方差齐，采用LSD进行两两比较，方差不齐，则采用Games-Howell；若不符合正态分布，采用随机区组设计资料秩和检验。

3 结果

3.1 5组大鼠神经元病理形态学变化 正常组和假手术组神经细胞结构正常，排列整齐紧密，神经细胞轮廓清晰，形态正常，细胞浆丰富呈淡红色，细胞核居中呈蓝色，无神经元丢失。模型组干预7 d，神经细胞排列不规整，胞浆淡染，细胞间隙扩大，细胞核固缩、深染；干预14 d，神经细胞排列紊乱，常有核固缩、裂解，细胞结构消失，神经细胞变性坏死，胶质细胞相对增多，伴有炎性细胞浸润；干预21 d，可见大量神经细胞丢失，细胞间隙明显增大，存在空腔形成或成空隙状。对照组和治疗组各时间点神经元病理损伤有所减轻，以治疗组改善最为明显。见图1。

图1 5组大鼠皮质区神经元HE染色图（×400）

3.2 5组大鼠血清TF、TFPI水平的比较 假手术组各时间点血清TF、TFPI水平均与正常组相当（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组各时间点血清TF水平均明显升高（P＜0.05），血清TFPI水平于干预7 d明显升高（P＜0.05），于干预14、21 d明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组和对照组各时间点血清TF水平均下降（P＜0.05），血清TFPI水平均升高（P＜0.05），治疗组改善程度优于对照组（P＜0.05）。见表1。

表1 5组大鼠不同时间血清TF、TFPI表达水平比较（±s）

表1 5组大鼠不同时间血清TF、TFPI表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05；与模型组比较，3）P＜0.05；与对照组比较，4）P＜0.05。

组别n7 d TF/（1 p4g d/mL）21 d正常组15218.78±13.85226.92±11.72224.39±8.77假手术组10216.30±8.93223.37±9.68228.93±3.14模型组13280.32±5.961）2）280.12±3.531）2）256.98±6.901）2）对照组28264.04±9.531）2）3）263.09±6.621）2）3）247.17±8.191）2）3）治疗组29254.32±2.971）2）3）4）255.75±5.491）2）3）4）239.06±7.641）2）3）4）组别n 7 d TFPI/（14 n d g/mL）21 d正常组15323.65±4.92329.98±9.49332.59±3.37假手术组10323.09±9.15331.13±7.70330.66±9.02模型组13343.21±7.981）2）304.96±4.121）2）312.89±3.621）2）对照组28353.14±3.611）2）3）319.98±7.371）2）3）321.12±4.771）2）3）治疗组29363.93±6.841）2）3）4）343.89±7.161）2）3）4）353.03±6.211）2）3）4）

3.3 5组大鼠脑组织TF、TFPI水平比较 假手术组各时间点脑组织TF、TFPI水平均与正常组相当（P＞0.05）；与假手术组比较，模型组各时间点脑组织TF水平均明显升高（P＜0.05），脑组织TFPI水平于干预7 d明显升高（P＜0.05），于干预14、21 d明显下降（P＜0.05）；与模型组比较，治疗组和对照组各时间点脑组织TF水平均下降（P＜0.05）、脑组织TFPI水平均升高（P＜0.05），治疗组改善程度优于对照组（P＜0.05）。见表2。

表2 5组大鼠不同时间脑组织TF、TFPI表达水平比较（±s）

表2 5组大鼠不同时间脑组织TF、TFPI表达水平比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.05；与假手术组比较，2）P＜0.05；与模型组比较，3）P＜0.05；与对照组比较，4）P＜0.05。

组别n7 d TF/（14 p gd/g）21 d正常组152 199.91±78.562 250.34±80.032 256.51±54.40假手术组102 178.75±36.732 278.12±70.232 255.09±30.32模型组132 619.42±43.181）2）2 585.54±36.921）2）2 572.49±30.131）2）对照组282 515.56±45.081）2）3）2 496.13±34.001）2）3）2 448.37±53.171）2）3）治疗组292 447.70±32.791）2）3）4）2 399.99±37.771）2）3）4）2 344.35±48.161）2）3）4）组别n7 d TFPI 1/（4 n d g/g）21 d正常组155 234.28±64.685 232.13±37.515 258.74±28.46假手术组105 178.25±52.635 229.11±16.995 265.25±30.55模型组135 356.70±41.771）2）5 070.45±36.851）2）5 095.89±33.271）2）对照组285 445.56±47.591）2）3）5 145.20±42.021）2）3）5 178.66±54.641）2）3）治疗组295 504.92±49.071）2）3）4）5 300.76±40.201）2）3）45 386.06±74.881）2）3）4）

4 讨论

HIE是新生儿的常见疾病，具有较高的致残率和致死率［11］。中医学认为，HIE归属中医“胎怯”“五迟”“五软”“五硬”等范畴，其病位在脑，病机是髓海不充，脑髓失养，或脑脉痹阻，窍闭神匿，以疏通气血、醒脑益智、升举阳气、协调百脉为治则［12］。HIE是一个多因素、多机制的级联损伤过程，包括能量代谢障碍、细胞内钙离子超载、兴奋性氨基酸毒性、炎性反应、自由基和再灌注损伤、凋亡相关信号通路激活等，缺血缺氧在HIE的发生、发展过程中发挥重要作用，神经细胞凋亡或坏死是最终结果［13］。

本研究选取督脉和足太阳膀胱经，“病变在脑，首取督脉”，督脉为阳脉之海，总督诸阳；足太阳膀胱经为巨阳之脉，布散阳气，两者均入络于脑，形成督脉-足太阳-脑三者互相沟通的有机整体［14］，通过按摩督脉和膀胱经发挥振奋阳气、充养脑神、清窍健脑之功效［15］。刘家瑞等［16］发现，捏脊按摩可明显改善婴儿期脑瘫患儿运动发育迟缓。现代研究也表明，捏脊按摩对体表的机械性刺激可通过皮肤触觉感受器传至中枢神经系统，兴奋迷走神经以及内脏自主神经丛，促进内源性神经生长因子（NGF）的表达，使受损脑组织神经系统突触重建而发挥损伤修复作用［17-18］。捏脊按摩还可通过上调组织中Bcl-2的表达，抑制Cyt-C从线粒体释放，降低Caspase-3的表达，减少神经元凋亡反应的发生，阻止神经元坏死，从而发挥神经元保护作用［19］。本研究HE染色结果显示，治疗组和对照组各时间点神经元病理损伤程度较模型组均有所减轻，以治疗组改善最为明显，表明捏脊按摩联合GM1可抑制HIE模型大鼠神经细胞损伤和凋亡，优于单一使用GM1，与张林峰［19］研究结果一致。因此，捏脊按摩可减轻HIE对大鼠的神经损害作用，改善HIE模型大鼠的神经元损伤和形态学改变。

HIE新生儿脑组织缺血缺氧时体内血液重新分布，血管内皮细胞受到损伤，TF暴露，内源性和外源性凝血系统被激活，凝血功能亢进，导致血液呈高凝状态，增加弥散性血管内凝血的可能［3］。TF是外源性凝血途径的启动因子，在机体生理性止血及病理性血栓形成过程中起重要作用；TFPI是目前唯一能生理性抑制TF启动外源性凝血途径的一种内源性抗凝蛋白，可以调节TF的活性［5］。本研究结果显示，模型组各时间点血清和脑组织TF水平均明显高于假手术组和正常组（P＜0.05），血清和脑组织TFPI水平于干预7 d升高，干预14、21 d均低于假手术组和正常组（P＜0.05），可能的原因是脑组织缺血缺氧引起受损的血管内皮细胞、单核细胞大量分泌TF，凝血功能亢进，TFPI与TF结合形成TFPI-FⅩa-FⅦa-TF四元复合物，被大量消耗所致［20］。与模型组比较，对照组各时间点血清和脑组织TF水平均下降（P＜0.05），TFPI水平均升高（P＜0.05），可能是由于GM1可通过血脑屏障，嵌入细胞膜，维持细胞内外离子平衡、防止细胞内钙离子聚集、抑制氧自由基、减少兴奋性氨基酸引发的神经毒性，增加受损脑组织血流量［21］。与对照组比较，治疗组各时间点血清和脑组织TF水平均明显降低（P＜0.05），TFPI水平均明显升高（P＜0.05）。本研究结果表明，捏脊按摩联合GM1可能通过调节TF、TFPI表达水平，降低HIE模型大鼠血液高凝状态，改善脑组织微循环，发挥治疗作用，治疗效果优于单一使用GM1，与吕桂芬［22］等的研究结果一致。因此，捏脊按摩可促进微血管扩张，改善血液流变学，从而阻断缺血缺氧引起的恶性循环。

综上所述，捏脊按摩联合GM1对HIE有良好的治疗作用，治疗效果优于单一使用GM1，其作用机制可能是通过调节TF、TFPI的表达，降低HIE模型大鼠血液高凝状态，改善脑组织的血液循环和营养供应，从而抑制HIE模型大鼠神经细胞凋亡和坏死，促进神经系统损伤的修复，发挥神经保护作用。