八宝丹抑制胃癌细胞移植瘤生长及上皮-间质转化

魏丽慧，刘建鑫，黄 彬，方 翌，林久茂*

（1.福建中医药大学中西医结合研究院，福建福州 350122；2.福建省中西医结合老年性疾病重点实验室，福建福州 350122；3.中西医结合基础福建省高校重点实验室，福建福州 350122）

胃癌（gastric cancer，GC）是一种常见的恶性肿瘤。据统计，全世界每年有100多万新病例，是男性第四常见的癌症，女性第七常见的癌症［1-3］。尽管在外科手术和辅助治疗方面取得了很大的进展，但胃癌的高转移率，五年生存率仍较低［4］。因此，防治肿瘤转移是提高胃癌患者生存率及生活质量的重要方式。研究发现，细胞发生上皮-间充质转化（EMT）是肿瘤细胞转移的起始因素［5］。通过EMT过程，上皮细胞极性丧失，细胞间连接中断，细胞骨架重组，细胞形态由扁平变为梭形，由此侵入血液系统并转移到其他器官［6］。因此寻找逆转EMT的药物是当前亟待解决的重要问题。

中医注重未病先防、已病防变的治“未病”，符合胃癌当前的治疗现状。已有四百多年历史的传统中药复方八宝丹，由天然牛黄、蛇胆、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香等名贵中药材组成，具有清热解毒、活血化瘀、去黄止痛之效，临床上被广泛用于肿瘤和炎症的治疗［7-10］。前期研究表明，八宝丹具有抑制胃癌细胞增殖、诱导细胞凋亡及抑制转移的作用［11-13］，但是否具有逆转EMT作用及作用机制尚未见报道。因此，本课题拟在前期实验的基础上，通过构建MGC80-3裸鼠皮下移植瘤模型，观察八宝丹对胃癌细胞EMT的影响及调控机制，进一步丰富八宝丹的抗癌作用及作用机制。

1 实验材料

1.1 实验细胞 人胃癌细胞株MGC80-3购于中国科学院上海生科院细胞资源中心，保存于福建中医药大学中西医结合研究院实验中心液氮罐中。

1.2 实验动物 BALB/c裸鼠，20只，雄性（18～20 g，4周龄，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证：SCXK（沪）2018-0016，在福建中医药大学实验中心动物房SPF级实验室饲养，实验室温度湿度恒定，每天光照时间12 h，正常饮水及饮食。

1.3 实验药物 八宝丹（厦门中药厂，批号：180101），组方主要包括天然牛黄、蛇胆、珍珠、羚羊角、三七、天然麝香。

1.4 实验试剂 RPMI-1640培养基、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素、胰蛋白酶、磷酸盐缓冲液（PBS）、BCA法蛋白定量分析试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司）；SDS-PAGE配制凝胶试剂盒、NC膜（德国Merck Millipore公司）；超敏ECL化学发光试剂盒（苏州宇恒生物科技有限公司）；一抗、二抗稀释液（武汉博士德生物工程有限公司）；E-cadherin、Vimentin、Smad2/3及p-Smad2/3（美国CST公司）；MMP2、MMP9、TGF-β1、β-actin、兔二抗及鼠二抗（美国Proteintech Group公司）。

1.5 实验仪器 超净工作台（苏州净化设备有限公司）；二氧化碳培养箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；超低温冰箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）；Countes®全自动细胞计数仪（美国Life公司）；干式恒温金属浴（上海培清科技有限公司）；小型垂直电泳槽、Trans-Blot小型转印槽转膜仪、超高灵敏化学发光成像系统（美国Bio-Rad公司）。

2 实验方法

2.1 八宝丹药液配制 用生理盐水将八宝丹配成浓度为25 mg/mL的八宝丹母液，存于4℃冰箱备用。

2.2 细胞完全培养基配制 在RPMI-1640空白培养基中加入10%体积的胎牛血清和1%体积的青霉素-链霉素，存于4℃冰箱备用。

2.3 裸鼠皮下移植瘤模型构建 MGC80-3细胞以1.5×105个/mL的密度接种于75 cm2的大培养瓶中，每瓶15 mL，观察细胞状态，当细胞的汇合度长到90%～100%时，用0.25%EDTA胰蛋白酶消化细胞，待细胞从培养瓶底部脱落后加入5 mL的完全培养基终止消化。离心，细胞沉淀用空白RPMI-1640培养基清洗3次后重悬，调整细胞密度为3×106个/mL，与基质胶1∶1充分混匀（冰上进行）。于每只裸鼠右前肢腋窝处注射200μL的细胞悬液，共计20只。接种后每日观察裸鼠的生长状态和移植瘤的生长情况。

2.4 动物分组与给药 瘤体长约至80～100 mm3时，按瘤体体积随机分为对照组和八宝丹组各10只。八宝丹组按0.25 mg/kg予八宝丹药液灌胃，对照组予等容积的生理盐水灌胃，每周给药6 d。隔日对裸鼠进行称重、测量瘤体最长径L和最短径W，计算移植瘤体积，绘制移植瘤的生长曲线图。

2.5 动物取材和标本采集 注射2%的戊巴比妥钠麻醉后用颈椎脱臼法将裸鼠处死，将瘤体组织剥离取出，先保存于液氮中。

2.6 Western blot法检测蛋白表达 瘤体放置2 mL的离心管中，加入研磨钢珠进行研磨，分别加入300～500μL的RIPA裂解液，提取总蛋白。然后用BCA定量试剂盒进行定量。每组样本取50μg的蛋白上样，进行电泳，结束后，将蛋白转移至NC膜上，加入相应的一抗4℃孵育过夜，用TBST清洗3次后，孵育二抗，2 h后用TBST清洗3次，最后于化学发光成像系统显影、拍照。

2.7 HE染色法观察肝、肾组织形态 肝、肾组织于多聚甲醛溶液中固定48 h后，再转移至70%无水乙醇脱水12 h。将肝、肾组织取出，修剪成合适大小（0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm）的组织块，接着进行脱水，石蜡包埋，切片，烤片，脱蜡，苏木素染色，伊红染色，吹干，封片。在Leica显微镜下随机选取六个视野进行拍照。

2.8 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，方差齐者采用单因素方差分析；方差不齐者采用秩和检验。不符合正态分布者采用非参数检验。

3 结果

3.1 八宝丹抑制移植瘤的生长 如图1所示，给药第7天开始，八宝丹组裸鼠移植瘤的体积明显低于对照组（P＜0.05）。如图2所示，2组裸鼠体质量差异无统计学意义（P＞0.05）。以上实验结果表明，八宝丹具有抑制MGC80-3细胞移植瘤生长的作用，对裸鼠的体质量无影响。

图1 2组裸鼠瘤体体积比较

图2 2组裸鼠体质量比较

3.2 2组裸鼠瘤体中E-cadherin、Vimentin蛋白表达比较 如图3所示，与对照组比较，八宝丹组中E-cadherin的表达明显上调（P＜0.05），Vimentin的表达明显下调（P＜0.05），提示八宝丹具有逆转胃癌细胞EMT的作用。

图3 2组裸鼠瘤体中E-cadherin、Vimentin蛋白表达比较

3.3 2组裸鼠瘤体中MMP2、MMP9蛋白表达比较如图4所示，与对照组比较，八宝丹组中MMP2和MMP9蛋白的表达显著下调（P＜0.05），提示八宝丹可能通过抑制MMP2和MMP9的表达，从而抑制胃癌移植瘤生长及EMT。

图4 2组裸鼠瘤体中MMP2、MMP9蛋白表达比较

3.4 八宝丹抑制移植瘤细胞TGF-β/Smad信号通路的活化 如图5所示，与对照组比较，八宝丹组中TGF-β1、p-Smad2/3的表达明显下调（P＜0.05），而总蛋白Smad2/3没有改变（P＞0.05），提示八宝丹具有抑制裸鼠皮下移植瘤细胞TGF-β/Smad信号通路活化的作用。

图5 2组裸鼠瘤体TGF-β、p-Smad2/3、Smad2/3蛋白表达比较

3.5 2组裸鼠肝、肾组织病理形态观察 如图6所示，2组肝细胞无水肿及坏死，肝小叶结构正常、分界明显，肝细胞索排列整齐，肝细胞索间可见不规则的肝血窦，窦腔内可见枯否氏细胞。2组肾小球结构清晰，无增生及固缩，肾小囊无膨大，毛细血管丛基底膜无增厚表现。实验结果提示八宝丹对裸鼠无肝、肾毒性。

图6 2组裸鼠肝、肾组织HE染色图（×400）

4 讨论

由于缺乏有效的肿瘤转移治疗方法，近十年来胃癌的病死率并没有明显下降。并且临床上许多胃癌患者被诊断时已发生转移。因此，迫切需要寻找有效的防治胃癌转移的药物。与现代化疗药物相比，中医注重未病先防、已病防变治“未病”，并且副作用少，越来越受到患者和临床医生的青睐。具有400多年历史的中药复方八宝丹，在包括肿瘤等多种疾病中发挥很好的治疗作用，可以消除肿块、去除炎症、减轻疼痛，并且辅助化疗可以提高临床疗效，改善患者的不良反应［7-13］。因此，本课题在此研究基础上，进一步观察及阐明八宝丹防治胃癌转移及其作用机制。首先构建了胃癌细胞皮下裸鼠移植瘤模型，证实八宝丹具有抑制瘤体生长的作用，并对裸鼠体质量没有明显的影响。这与课题组前期报道的结果一致。另外，大量的证据表明，上皮性癌细胞在早期入侵血液或转移到其他组织是由EMT驱动的［5］。细胞在发生EMT时，失去了细胞极性，与周围和基质细胞接触减少，细胞迁移和运动能力增加；同时细胞表型发生了改变，细胞丧失上皮表型，如E-钙黏素（E-cadherin）减少，获得间充质表型，如Vimentin、纤连蛋白、N-钙黏素等增加［6］。因此，本实验同时检测了移植瘤瘤体中EMT相关的蛋白表达，结果表明八宝丹显著提高E-cadherin表达，降低Vimentin表达。研究提示，八宝丹具有逆转胃癌细胞EMT的作用。

研究报道，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）属于锌依赖性内肽酶家族，其功能主要是降解细胞外基质（ECM），维持细胞外基质的动态平衡。其中，MMP2和MMP9是其重要的成员，在肿瘤的发生、发展、转移过程中发挥调控的作用，可以促进肿瘤细胞生长、侵袭和转移，促进肿瘤血管形成［14］。因此在本实验中，也观察了八宝丹对MMP2和MMP9蛋白的影响。结果发现八宝丹显著的抑制MMP2和MMP9蛋白的表达。

EMT受多条信号通路调控，其中TGF-β/Smad通路是其经典调控通路之一［6］。研究发现TGF-β与细胞表面受体结合后，形成异源三聚体，异源三聚体通过磷酸化激活受体调节型Smad（R-smad）蛋白，磷酸化的R-smad蛋白在胞浆中累积，与共同调节型（Co-smad）smad蛋白结合后，在Co-smad蛋白的帮助下，转移至细胞核，与靶基因结合，进而调节细胞增殖、凋亡及EMT相关蛋白的表达。其中Rsmad包括smad2、smad3；Co-smad包括smad4［15］。另外，TGF-β还可诱导MMP-2、MMP9的表达，促进基底膜降解，为肿瘤细胞快速生长、侵袭提供良好的环境，导致肿瘤发生与发展［16］。本研究结果显示，八宝丹可以下调TGF-β1和p-Smad2/3的表达，证实八宝丹可以阻断TGF-β/Smad信号通路的活化。但是，对于八宝丹是否通过抑制TGF-β/Smad信号通路的活化发挥抑制胃癌细胞增殖及逆转EMT进程还需要进一步验证。

另外，药物的安全性问题一直以来是中药临床应用关注的热点。为了评价八宝丹的药物安全性和探究是否对裸鼠具有肝、肾的毒理作用。在本课题研究中，首先观察实验过程中裸鼠的生长状况，确认了实验过程中无裸鼠死亡，且活动度可、状态良好。在动物实验结束后，对裸鼠体质量进行动态分析，发现八宝丹对裸鼠体质量没有影响。并运用HE染色观察裸鼠的肝、肾的细胞形态，结果表明八宝丹没有改变裸鼠肝、肾的细胞形态。

综上所述，八宝丹具有抑制胃癌生长及逆转细胞EMT的作用，下调MMP2、MMP9蛋白的表达及抑制TGF-β/Smad信号通路的活化可能是其重要的调控机制之一。