蛇伤胶囊对竹叶青蛇伤血管内皮细胞Cyt-C/Bcl-2信号通路的影响

文 丹，吴 晖，邵 丹，何卫东，郑建新

（福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004）

竹叶青蛇是我国常见毒蛇之一，安全有效治疗竹叶青蛇伤尤为重要。竹叶青蛇伤患者多出现伤口局部肿胀、疼痛、出血，皮肤散在血水疱及瘀斑，伤肢水肿明显，发热，口干，小便少，大便干硬或便秘等火毒证表现，“火毒损络”是竹叶青蛇伤的基本病机，竹叶青蛇伤的中医治疗应立足于泻火解毒法。前期基础研究发现，竹叶青蛇毒导致血管内皮细胞炎症损伤，引起细胞凋亡；而蛇伤胶囊能够对抗竹叶青蛇毒的损害，具有抑制细胞凋亡的作用，临床疗效显著［1-6］。细胞色素C（cytochrome c，Cyt-C）从线粒体释放是细胞凋亡的关键步骤，B淋巴细胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）家族相关凋亡因子是影响细胞线粒体凋亡途径的重要调控因素，因此本研究从Cyt-C/Bcl-2信号通路研究竹叶青蛇伤络脉损伤的病理机制，进一步阐明泻火解毒法治疗竹叶青蛇伤络脉损伤的作用机理。

1 实验材料

1.1 实验动物和细胞 5月龄雄性新西兰大白兔20只，体质量2.5～3.0 kg，由福建中医药大学动物实验中心提供，动物许可证号：SYXK（闽）2018-0006。所有兔子实验前适应性喂养3 d。人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.2 实验药物 蛇伤胶囊为福建中医药大学附属人民医院院内制剂（闽药制字Z06106044），组成包括：大黄、黄连、山慈菇、土木香、白芷、雄黄、冰片等，药物规格：0.37g×50粒/瓶，成人用量5粒/次，每天4次。将蛇伤胶囊用蒸馏水配成69.6 mg/mL浓度的蛇伤胶囊药液用于灌胃。

1.3 实验试剂 磷酸酶抑制剂、RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司提供，批号：S1873、P0013B、P0010）；HRP标记羊抗小鼠二抗、HRP标记羊抗兔二抗、HRP标记兔抗羊二抗（武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1051、BA1054、BA1060）；山羊多抗凋亡诱导因子（AIF）、鼠单抗Cyt-C（英国Abcam公司，批号：ab32516、ab13575）；兔多抗GAPDH（杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R001）；兔多抗VDAC1（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：55259-1-AP）；ECL底物液（北京普利莱基因技术有限公司，批号：P1050）；Trizol（美国Ambion公司，批号：15596-026）；HiScript Reverse Transcriptase（RNase H）、SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，批号：R101-01/02、Q111-02）；ddH2O（DNase/RNase Free）（genecopoeia公司，批号：C1D230A）；Ribonuclease Inhibitor（TransGen公司，批号：AI101）；Taq Plus DNA Polymerase、DL2000 DNA Marker（TIANGEN公司，批号：ET105-01、MD114-02）；细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司，批号：KGA108）。

1.4 实验仪器 HI650离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；cytoFLEX流式细胞仪（美国Beckmancoulter公司）；JY300水平电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；DYCZ-电转仪、DYCZ-24DN垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；JY02S紫外分析仪（北京君意东方电泳设备有限公司）；Quant-Studio 6实时荧光定量PCR仪（美国ABI公司）；AJY-0501 Aquapro超级纯水仪（艾科浦）。

2 实验方法

2.1 含药血清制备 参照文献［6］制备含药血清。健康新西兰大白兔20只，常规饲养3 d后随机分成空白组和中药组，中药组用蛇伤胶囊药液灌胃，空白组用生理盐水灌胃，每日灌胃2次（8时和20时），连续灌胃5 d。所有兔子末次灌胃后2 h，心脏采血并置离心管中，37℃水浴2 h，2 000 r/min离心10 min分离血清，将血清于56℃灭活30 min。用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌分装，置-20℃冰箱中保存备用。

2.2 竹叶青蛇毒液配制 将竹叶青蛇毒冻干粉用灭菌生理盐水配成浓度为1 mg/mL的竹叶青蛇毒液，用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌分装，置4℃冰箱中保存。

2.3 细胞培养与干预 将HUVEC细胞接种于无菌培养瓶中，加入含10%胎牛血清的MEM培养液，置于37℃、5%CO2、95%湿度的无菌培养箱中培养。每1～2 d更换培养液；4～5 d细胞长满后传代。传代后的HUVEC以标准培养液培养24 h，更换培养液并随机分为5组。①正常组：MEM培养液加10%的正常兔血清培养；②模型组：正常组基础上加5μg/mL竹叶青蛇毒液培养；③低剂量含药血清组（简称低剂量组）：在模型组基础上培养6 h后加5%含药兔血清继续培养；④中剂量含药血清组（简称中剂量组）：在模型组基础上培养6 h后加10%含药兔血清继续培养；⑤高剂量含药血清组（简称高剂量组）：在模型组基础上培养6 h后加15%含药兔血清继续培养。各组分别培养72 h。

2.4 凋亡率检测 各组分别培养72 h后，磷酸盐缓冲液漂洗，参照AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒说明书，每个样本加入500μL Binding Buffer，重悬细胞；5μL AnnexinV-FITC混匀后加入5μL PI，混匀；室温避光反应5～15 min（同时设阴性对照，即正常细胞不加Annexin和PI；阳性对照1，以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照，只加5μL AnnexinV单标；阳性对照2，以凋亡效果最明显的溶剂组作为阳性对照，只加5μL PI单标），流式细胞仪上机检测。

2.5 Western blot法检测细胞浆及线粒体内Cyt-C、AIF蛋白表达 收集各组培养后的HUVEC细胞，使用裂解液、蛋白酶抑制剂制备蛋白样本，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白样品浓度，蛋白变性后经SDS-PAGE电泳后并转至PVDF膜。5%脱脂奶粉封闭2 h，分别加入GAPDH、VDAC1多克隆抗体（1∶1 000）、山羊多抗AIF（1∶10 000）和鼠Cyt-C抗体（1∶5 000），4℃孵育过夜，TBST洗4次，每次5 min，二抗（1∶8 000）室温孵育2 h，TBST洗膜，用ECL化学发光显色液，显影读片，应用Image-J软件分析条带的灰度值。胞浆Cyt-C、AIF蛋白相对表达以Cyt-C、AIF蛋白灰度值与GAPDH蛋白内参灰度值比值表示，线粒体Cyt-C、AIF蛋白相对表达以Cyt-C、AIF蛋白灰度值VDAC1蛋白内参灰度值比值表示，各重复3次取均值。

2.6 qPCR检测HUVEC细胞凋亡相关因子mRNA表达 收集各组培养后的HUVEC细胞，采用Trizol法提取细胞总RNA并反转录为cDNA，根据SYBRPremix Ex Taq试剂盒说明书制备qPCR反应体系，反应参数：95℃15 min，95℃15 s，60℃60 s，95℃15 s，40个循环。引物合成由福州韦伯康生物科技有限公司完成。GAPDH上游引物5’-TCAAGAAG GTGGTGAAGCAGG-3’，下游引物5’-TCAAAGGT GGAGGAGTGGGT-3’；Bax上游引物5’-AAGAAG CTGAGCGAGTGTCT-3’，下游引物5’-GTTCTGAT CAGTTCCGGCAC-3’；Bcl-2上游引物5’-GCCTTC TTTGAGTTCGGTGG-3’，下游引物5’-GAAATCAA ACAGAGGCCGCA-3’；Bak上游引物5’-GGGACG ACATCAACCGACG-3’，下游引物5’-CCAGAAGA GCCACCACACG-3’；Bad上游引物5’-AGTCGCCA CAGCTCCTACCCC-3’，下游引物5’-CCTGCCCAA GTTCCGATCCCA-3’；Bid上游引物5’-TTGGGAA GAATAGAGGCAGA-3’，下游引物5’-GACATCAC GGAGCAAGGACG-3’；Bcl-xl上游引物5’-ACAAT GCAGCAGCCGAGAGC-3’，下游引物5’-TCCGAC TGAAGAGTGAGCCC-3’；Bcl-w上游引物5’-CGC CTTGTAGCCTTCTTT-3’，下游引物5’-CTGATGCC CAGTTCCCCT-3’；Caspase-3上游引物5’-ACTGG ACTGTGGCATTGAGA-3’，下游引物5’-GCACAA AGCGACTGGATGAA-3’；Caspase-9上游引物5’-ACATGCTGGCTTCGTTTCTG-3’，下游引物5’-TCT CAAGAGCACCGACATCA-3’，以GAPDH为内参，采用2－ΔΔCt方法计算Bax、Bak、Bad、Bid、Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的mRNA表达量。

2.7 统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件分析。符合正态分布的计量资料以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 5组HUVEC细胞凋亡率比较见图1、表1。

图1 5组HUVEC细胞流式细胞图

表1 5组HUVEC细胞凋亡率比较（±s，n＝3）

表1 5组HUVEC细胞凋亡率比较（±s，n＝3）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量组比较，3）P＜0.01；与中剂量组相比，4）P＜0.01。

凋亡率/%8.08±0.06 35.09±1.171）26.46±1.151）2）13.35±0.931）2）3）19.34±0.961）2）4）组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组

3.2 5组HUVEC细胞浆及线粒体内Cyt-C、AIF蛋白表达比较见图2、表2。

图2 5组HUVEC细胞浆及线粒体内Cyt-C、AIF蛋白电泳图

表2 5组HUVEC细胞浆及线粒体内Cyt-C、AIF蛋白表达比较（±s）

表2 5组HUVEC细胞浆及线粒体内Cyt-C、AIF蛋白表达比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量组比较，3）P＜0.01；与中剂量组比较，4）P＜0.01。

线粒体AIF 0.64±0.11 0.16±0.061）0.29±0.071）2）0.50±0.071）2）3）0.38±0.071）2）4）组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组胞浆Cyt-C 0.17±0.08 0.77±0.091）0.62±0.091）2）0.39±0.121）2）3）0.49±0.111）2）4）胞浆AIF 0.16±0.07 0.74±0.121）0.61±0.121）2）0.39±0.081）2）3）0.49±0.101）2）4）线粒体Cyt-C 0.74±0.14 0.19±0.091）0.36±0.021）2）0.57±0.141）2）3）0.46±0.131）2）4）

3.3 5组HUVEC细胞凋亡相关因子的mRNA表达比较见表3。

表3 5组HUVEC细胞凋亡相关因子的mRNA表达（±s，n＝3）

表3 5组HUVEC细胞凋亡相关因子的mRNA表达（±s，n＝3）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与低剂量组比较，3）P＜0.01；与中剂量组比较，4）P＜0.01。

组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组Bax 1.00±0.00 4.13±0.321）3.29±0.31）2）1.79±0.21）2）3）2.39±0.191）2）4）Bcl-w 1.00±0.00 0.31±0.061）0.48±0.061）2）0.84±0.061）2）3）0.63±0.041）2）4）Bak 1.00±0.00 5.01±0.461）1.79±0.21）2）1.90±0.141）2）3）2.92±0.241）2）4）Bcl-2 1.00±0.00 0.31±0.061）0.45±0.081）2）0.83±0.051）2）3）0.62±0.041）2）4）Bad 1.00±0.00 3.17±0.271）2.53±0.261）2）1.43±0.141）2）3）1.81±0.181）2）4）Caspase-3 1.00±0.00 4.02±0.21）3.14±0.291）2）1.71±0.211）2）3）2.43±0.121）2）4）Bid 1.00±0.00 4.28±0.251）3.49±0.171）2）1.88±0.191）2）3）2.65±0.21）2）4）Caspase-9 1.00±0.00 4.11±0.291）3.29±0.31）2）1.77±0.21）2）3）2.44±0.121）2）4）Bcl-xl 1.00±0.00 0.29±0.051）0.44±0.081）2）0.80±0.071）2）3）0.60±0.041）2）4）

4 讨论

全世界每年有超过10万人因毒蛇咬伤中毒死亡，40万人身体残疾。毒蛇咬伤尤其对山区、农村和贫困地区产生了很大影响［7］。据《柳叶刀》报道，全球约有9 260多万人生活在易受毒蛇伤害的地区，并指出抗蛇毒血清的缺乏给临床治疗带来困难［8-9］。我国南方地区气候湿热，加上环境和生物保护政策，竹叶青蛇数量众多，竹叶青蛇伤发病率、病死率和伤残率非常高。竹叶青蛇伤患者以火毒证为主要表现，“火毒损络”是基本病机，泻火解毒法是基本治则。具有泻火解毒功效的蛇伤胶囊是我院院内制剂，治疗竹叶青蛇伤临床疗效显著，但泻火解毒法治疗竹叶青蛇伤的机制还不明确，影响了泻火解毒法在蛇伤治疗方面的进一步应用。

课题组前期研究发现，竹叶青蛇伤时炎症因子TNF-α、IL-1、IL-6等明显升高，血管内皮细胞NF-κB活性增强，ICAM-1、VCAM-1、MCP-1等表达增加，进而再次激活NF-κB，使炎症因子产生、释放增多，细胞损伤加重［2-5］。竹叶青蛇伤时存在明显的血管内皮细胞损伤，竹叶青蛇出血毒素可破坏血管内皮的结构和功能，导致内皮细胞变性，引起细胞凋亡，而泻火解毒法代表方蛇伤胶囊能够对抗竹叶青蛇毒的损害，减轻内皮细胞损伤，抑制细胞凋亡，其具体作用机制需要进一步研究。线粒体/细胞色素C相关因子在细胞凋亡中具有重要作用。因此，本研究通过细胞实验，围绕Cyt-C/Bcl-2介导的细胞凋亡通路，研究蛇伤胶囊干预竹叶青蛇伤血管内皮细胞凋亡的作用机制。

线粒体是细胞凋亡调控中心，多数凋亡刺激因子通过线粒体激活细胞凋亡途径。细胞凋亡与线粒体的结构与功能有着密切的关系，在炎症、氧化应激等相关因素刺激下，线粒体通透转换孔开通，从而降低线粒体膜电位，引起Cyt-C及AIF等凋亡因子释放到胞浆中，诱导细胞凋亡［10-11］。Caspase是含半胱氨酸的一组天冬氨酸蛋白水解酶，正常的细胞中，Caspase以非活化的酶原形式存在，在各种促凋亡信号刺激下，起始蛋白Caspase-9被激活，继而激活下游的Caspase-3，启动级联反应，介导细胞凋亡。Cyt-C是一种含血红素的蛋白，存在于线粒体内侧外膜上，随着线粒体通透性增大，Cyt-C被释放到胞浆中，与凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及无活性Caspase-9酶原结合形成凋亡小体，凋亡小体促进Caspase-9酶原裂解形成有活性的Caspase-9，进而激活Caspase-3，最终促进细胞凋亡［12-13］。Cyt-C的表达增加、Caspase-9和Caspase-3的活性增加，三者的级联反应与细胞过度凋亡与有关，而下调Cyt-C的表达可降低Caspase-9和Caspase-3的活性，减少细胞凋亡［14-15］。Bcl-2蛋白家族是一组含有与Bcl-2同源BH结构域、功能相关的蛋白质，其可通过调节线粒体外膜的通透性而发挥调节细胞凋亡的作用，根据功能和结构可将其分为两类，一类为促进凋亡，包括Bax、Bak、Bad、Bid；一类为抗凋亡，包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。其中Bak和Bax通过寡聚化在线粒体外膜上形成孔道，提高线粒体外膜通透性，促进线粒体释放Cyt-C进入胞浆，诱导细胞凋亡的发生，是调节细胞凋亡进程中发挥效应作用的蛋白质。Bcl-2、Bcl-xl可以与Bax形成异源二聚体，减少Bax同源二聚体形成，减少线粒体外膜上孔道形成，从而抑制Bax引起的凋亡［16-17］。AIF是一种线粒体黄素蛋白，存在于线粒体膜间隙，能够诱导细胞凋亡，主要介导非Caspase依赖性的细胞凋亡途径。在接收到凋亡信号后，AIF从线粒体中释放到胞浆，并转位到细胞核内，促进DNA大片段断裂，引起染色体核周边凝集，最终导致细胞凋亡［18-20］。而减轻线粒体通透性，减少AIF从线粒体释放到胞浆和阻止其向细胞核内转移能减轻细胞凋亡［21］。下调Apaf-1、AIF、Caspase-3、Bax mRNA表达，上调Bcl-2 mRNA表达可明显减轻内皮细胞核固缩，线粒体肿胀，减轻细胞凋亡［22］。

本研究结果显示，在竹叶青蛇伤细胞模型中，血管内皮细胞线粒体中Cyt-C、AIF明显降低，胞浆中Cyt-C、AIF明显升高，具有促凋亡作用的Bax、Bak、Bad、Bid明显升高，具有抗凋亡作用的Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2明显降低，Caspase-9、Caspase-3及凋亡率明显升高，提示经线粒体途径介导的细胞凋亡是竹叶青蛇伤后血管内皮细胞损伤的重要机制，其可能通过增加Bax、Bak、Bad、Bid等促凋亡蛋白，抑制Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2等抗凋亡蛋白，提高血管内皮细胞线粒体膜通透性，促进线粒体上Cyt-C及AIF释放进入胞浆，进而通过Cyt-C激活Caspase-9、Caspase-3级联反应与AIF介导的非Caspase途径促进细胞凋亡。低、中、高剂量的蛇伤胶囊均能够增加抗凋亡蛋白Bcl-xl、Bcl-w、Bcl-2的表达，降低促凋亡蛋白Bax、Bak、Bad、Bid的表达，抑制线粒体中Cyt-C、AIF释放进入胞浆，下调Caspase-9、Caspase-3的表达，而且以中剂量的蛇伤胶囊最为适宜。

综上所述，结合前期研究，蛇伤胶囊能够通过调控线粒体/Cyt-C介导的细胞凋亡信号通路抑制竹叶青蛇伤血管内皮细胞凋亡，从而治疗竹叶青蛇伤及其引起的血管损伤，一定程度上阐明了泻火解毒法治疗竹叶青蛇伤络脉损伤的作用机理。