水蜈蚣对急性肝损伤小鼠的保护作用及机制研究

陈 燕，简凤娇，杨静红，林东贤，陈亚萍

（福建中医药大学药学院，福建福州 350122）

肝脏急慢性炎性是导致肝纤维化，甚至肝硬化、肝癌发生的重要始动因素［1］。目前现代医学还未发现理想的治疗肝损伤药物，鉴于此人们把目光转向传统医学，研发新型的中药制剂。中医学者认为湿热内蕴是慢性肝炎的重要病理环节，故肝炎中医治疗以清热祛湿、疏肝理气、祛瘀通络为原则［2］。水蜈蚣（K yllinga b revifoliaRottb.）为莎草科水蜈蚣属（K ylli ngaRottb）短叶水蜈蚣，主要分布于安徽、浙江、福建、湖南、广东等地区［3］，具有疏风解毒、清热利湿的作用，临床可治疗肝炎、黄疸、气管炎、疟疾等疾病［4-5］。水蜈蚣治疗肝病理论上符合中医治疗肝炎“清热祛湿”的原则。现代药理研究证明，水蜈蚣对小鼠具有镇静和抗焦虑［6］、减轻氧化应激、抗脂质过氧化［7］、清除自由基等作用［8-9］。水蜈蚣是否有对急性肝损伤有保护作用，未见相关研究。因此，本研究探讨水蜈蚣对小鼠急性肝损伤作用，并通过生物化学检测技术，分析水蜈蚣抗急性肝损伤与脂质过氧化及相关标志物水平、免疫细胞因子的关系，以期初步探明水蜈蚣抗急性肝损伤的可能机制，为水蜈蚣的保护肝损伤的临床用药提供理论依据，并为清热祛湿治疗肝病的中医传统疗法进行现代科学阐释。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级健康雄性ICR小鼠，体质量18～20 g，由吴氏实验动物提供，合格证号：SCXK（闽）2016-0002。

1.2 实验药物 水蜈蚣全草购自福建省福州市西洪路草药店，经福建中医药大学药学院中药鉴定教研室卢伟教授鉴定为莎草科植物水蜈蚣（K ylli nga br evifoli aRottb）；联苯双酯滴丸（北京协和药厂）。

1.3 实验试剂 分析纯CCL4（国药集团化学试剂有限公司，批号：20191109）；食用花生油（山东鲁花集团有限公司，批号：GB1534）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷草转氨酶（GOT）、谷丙转氨酶（GPT）试剂盒（南京建成生物工程研究所，批号：A003-1、A003-1、C010-2、C009-2）；BCA蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号P0012）；4%多聚甲醛溶液（武汉塞维尔生物科技有限公司，批号：YP184309）。

1.4 实验仪器 Infinite M200 PRO多功能酶标仪（瑞士TECAN公司）；DMi8倒置荧光显微镜（德国Leica公司）；HM325石蜡切片机（美国Thermo公司）；YT-7FB生物组织摊烤机、YB-6LF生物组织石蜡包埋机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；TS-12D生物组织自动脱水机（湖北孝感宏业医用仪器有限公司）；5418 R低温高速离心机（美国Eppendorf公司）。

2 实验方法

2.1 药液制备

2.1.1 水蜈蚣水煎液制备 称取69 g水蜈蚣干草，蒸馏水浸泡15 min后，煎煮2次，每次1 h，将2次溶液合并，抽滤，弃去杂质。将总溶液减压浓缩至1.44 g/mL，置-20℃冰箱中储存，临用前解冻至室温。

2.1.2 联苯双酯溶液制备 精密称取联苯双酯滴丸800 mg，置于研钵中，研碎，加入生理盐水80 mL，混匀后备用。

2.2 水蜈蚣最大耐受量试验 同“2.1.1”制备水蜈蚣水煎液，浓度0.96 g/mL，10只ICR小鼠每6 h按30 mL/kg予水蜈蚣水煎液灌胃给药，连续给药3次，观察小鼠的存活状态及生理活动，并计算最大耐受量。

2.3 动物分组、给药与造模 50只ICR小鼠按体质量随机数表法分为5组，分别为正常组、模型组、水蜈蚣低剂量组、水蜈蚣高剂量组、联苯双酯组。水蜈蚣低、高剂量组分别按1/6最大耐受量和1/3最大耐受量，即14.4、28.8 g/（kg·d）予水蜈蚣水煎液灌胃，联苯双酯组按0.2 g/（kg·d）予联苯双酯溶液灌胃，正常组和模型组予等量生理盐水灌胃，各组均连续灌胃13 d。末次给药1 h后，正常组按10 mL/kg腹腔注射花生油，其余4组小鼠按10 mL/kg予0.5%CCl4花生油溶液腹腔注射建立急性肝损伤小鼠模型，注射后小鼠禁食不禁水，染毒24 h后摘眼球取血，取小鼠肝组织并称重。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 小鼠肝脏指数的检测 染毒24 h后称量并记录小鼠体质量，摘眼球取血后处死小鼠，迅速剪开小鼠腹腔，取下完整肝脏并用预冷的生理盐水清洗，滤纸吸干，电子天平称量肝脏重量并记录，计算肝脏指数。

2.4.2 HE染色观察肝组织病理形态 取5组小鼠肝左叶中间部位，置于4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片。经HE染色，在光学显微镜下观察肝组织病理变化情况。

2.4.3 小鼠肝脏脂质过氧化水平检测 取小鼠肝脏100 mg，加入1 mL预冷生理盐水研磨，制成10%肝匀浆溶液，用台式冷冻离心机3 500 r/min离心15 min，取上清液于EP管中备用。根据相应试剂盒操作说明测定蛋白浓度，并计算SOD、MDA含量。

2.4.4 小鼠生化指标及血清炎症因子的测定 摘眼球取血后，在室温下静置2 h，待血液凝固后，将其放于冷冻离心机中，4℃、3 500 r/min的条件下离心15 min，将上清液（即血清）取至另一干净离心管中，保存于-20℃冰箱中备用。根据相应试剂盒说明检测血清中GPT、GOT活性；应用ELISA法检测血清中的TNF-α、IL-6的含量，根据MCP-RayBio试剂盒操作说明测定MCP-1的含量。

2.5 统计学方法 数据采用SPSS 18.0统计分析软件包和GraphPad Prism5软件进行处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组数据采用单因素方差分析，当差别有统计学意义时采用LSD-t或Dunnett-t检验对多个独立样本均数进行两两比较。

3 结果

3.1 水蜈蚣最大耐受量试验 灌胃给药后观察1周，发现小鼠均存活，状态良好，活泼无异常，计算最大耐受量为86.4 g/kg。

3.2 5组小鼠体质量、肝脏质量、肝脏指数比较 小鼠肝脏指数结果显示，模型组与正常组对比有显著统计学意义（P＜0.01），表明经CCL4损伤后，能明显引起小鼠肝脏重量增加，联苯双酯组、水蜈蚣低、高剂量组较模型组明显降低（P＜0.05），说明被水蜈蚣和联苯双酯治疗后，小鼠肝脏重量增加的情况有所好转，提示小鼠经治疗后可减轻肝脏的肿大。见表1。

表1 5组小鼠体质量、肝脏质量、肝脏指数比较（±s）

表1 5组小鼠体质量、肝脏质量、肝脏指数比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05。

肝脏指数/%4.78±0.24 5.40±0.451）4.82±0.332）4.99±0.552）4.78±0.512）组别正常组模型组联苯双酯组水蜈蚣低剂量组水蜈蚣高剂量组剂量g/（kg·d）——0.2 14.4 28.8体质量/g 25.42±3.61 24.38±2.71 24.46±3.73 24.45±2.60 25.20±2.47肝脏质量/g 1.22±0.22 1.31±0.14 1.18±0.17 1.22±0.18 1.20±0.18

3.3 肝脏组织病理形态观察 正常组小鼠肝小叶结构完整，肝索正常呈放射状，核仁明显，核膜清晰，未见肝细胞变性、坏死等。模型组可见肝细胞大量片状坏死，伴有炎性细胞浸润。联苯双酯组与模型组相比稍有好转，但仍可见部分肝细胞点状坏死；水蜈蚣低剂量组中肝脏病变程度较模型组减轻，局部可见肝细胞坏死；水蜈蚣高剂量组肝细胞结构完整，排列整齐，无明显肝细胞变性，仍可见少量炎性细胞浸润。结果说明水蜈蚣能改善肝损伤小鼠病理病变及坏死程度。见图1、图2。

图1 5组小鼠肝脏组织HE染色图（×200）

图2 5组小鼠肝脏病理损伤评分比较

3.4 5组小鼠肝组织SOD和MDA活力比较 与正常组比较，模型组小鼠肝组织SOD活力显著降低，MDA含量显著提高（P＜0.01）。与模型组比较，联苯双酯组和水蜈蚣低剂量组小鼠肝组织SOD活力明显提高，MDA含量明显降低（P＜0.05）；水蜈蚣高剂量组小鼠肝组织SOD活力显著提高，MDA含量显著降低（P＜0.01）。该结果表明，水蜈蚣可能通过抗氧化应激作用起到保肝效果。见表2。

表2 5组小鼠肝组织SOD和MDA活力比较（±s）

表2 5组小鼠肝组织SOD和MDA活力比较（±s）

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

组别正常组模型组联苯双酯组水蜈蚣低剂量组水蜈蚣高剂量组MDA/（nmol/mg）1.41±0.74 5.05±1.111）3.22±0.932）3.44±2.262）2.67±0.963）剂量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 SOD/（IU/mg）36.23±8.61 15.90±4.091）27.18±8.822）27.70±8.992）30.17±10.133）

3.5 5组小鼠血清GPT和GOT含量比较 与正常组比较，模型组血清GPT、GOT活力均显著升高（P＜0.01），表明CCL4致小鼠急性肝损伤模型建立成功。与模型组比较，水蜈蚣低剂量组和联苯双酯组小鼠血清GPT活力显著降低（P＜0.01），GOT活力明显降低（P＜0.05）；水蜈蚣高剂量组小鼠血清GPT、GOT活力均显著降低（P＜0.01），提示水蜈蚣对CCL4所致的急性肝损伤小鼠有降酶作用。见表3。

表3 5组小鼠血清GPT和GOT含量比较（±s） U/L

表3 5组小鼠血清GPT和GOT含量比较（±s） U/L

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

GOT 21.49±9.00 163.98±24.571）98.99±38.832）101.40±44.682）90.70±54.783）组别正常组模型组联苯双酯组水蜈蚣低剂量组水蜈蚣高剂量组剂量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 GPT 23.80±13.94 384.39±148.851）173.84±181.483）132.24±69.353）103.72±105.643）

3.6 5组小鼠血清炎症因子指标比较 与正常组比较，模型组小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量均显著提高（P＜0.01）。与模型组比较，联苯双酯组和水蜈蚣低剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量明显降低（P＜0.05）；水蜈蚣高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1含量显著降低（P＜0.01）。该结果表明，炎症反应可能是肝损伤的重要发病机制，而水蜈蚣可能通过抑制该发病机制起到保肝作用。见表4。

表4 5组小鼠血清炎症因子指标比较（±s） pg/mL

表4 5组小鼠血清炎症因子指标比较（±s） pg/mL

注：与正常组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

MCP-1 116.29±88.27 880.64±197.701）643.60±214.362）652.80±157.192）565.56±136.193）组别正常组模型组联苯双酯组水蜈蚣低剂量组水蜈蚣高剂量组剂量/［g/（kg·d）］——0.2 14.4 28.8 TNF-α 87.96±43.05 219.56±77.361）147.17±43.592）151.32±69.252）128.11±41.593）IL-6 41.89±28.74 139.79±65.001）71.76±16.562）75.22±60.622）80.95±25.113）

4 讨论

肝脏是体内代谢过程中重要的器官，同时也是各种致病因子或疾病攻击的对象，如药物、病毒、免疫性疾病等诱导因素致其受损，并继发瞬时的炎症反应，损伤的反复发生则引起肝脏的慢性炎症及过度的组织修复，最终发展为肝炎［10］。本次实验采用CCL4腹腔注射造成小鼠急性肝损伤，并用水蜈蚣水煎液进行干预，以此探究水蜈蚣对急性肝损伤的作用机制。联苯双酯滴丸是用于治疗肝炎的降酶药物，它对肝脏具有明显的保护作用［11］。动物实验表明，小鼠口服联苯双酯滴丸150～200 mg/kg就可减轻因CCl4所致的肝脏损害和GPT异常，该药对肝脏细胞中微粒体的过氧化脂质及CCl4组化生成CO有比较大的阻止作用，并且该药又可降低机体对CCl4分解解毒中还原辅酶及O2的消耗，从而达到保护肝细胞生物膜的药理作用［12］。因此在评价药物对小鼠CCL4所致肝损伤模型的保护作用时选其作为阳性药物。

CCL4是诱导小鼠急性肝损伤模型的经典诱导剂。当CCL4进入体内后经细胞色素P450激活会产生三氯甲基自由基和过氧化三氯甲基自由基，破坏细胞膜，使GPT、GOT大量流出［13］，造成血清中这两种酶的活性大大增高。因此检测小鼠血清中GPT、GOT的含量，可以判断小鼠肝细胞的损坏程度。CCL4被细胞色素P450酶氧化分解会产生较多可以调节各种免疫和炎症分子的表达，导致炎症反应加剧和组织损伤的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）［14］。而SOD是机体重要的抗氧化酶，具有清除自由基、抑制脂质过氧化的作用，从而保护细胞结构，可以反映机体的抗氧化能力［15］。MDA是脂质过氧化反应生成的终产物，它的产生与脂质过氧化平行，测定其含量不仅可反映脂质过氧化的程度，同时也间接反映了机体细胞损伤的程度及氧自由基水平［16］。本研究结果表明，水蜈蚣组和联苯双酯组GOT、GPT、MDA含量较模型组明显降低，SOD活性明显提高，提示水蜈蚣水煎液具有直接的肝损伤保护和抗炎活性，并且可能通过减轻脂质过氧化和氧化应激而改善CCl4所致肝损伤。

脂质过氧化反应产生的MDA等脂质过氧化物可趋化中性粒细胞，作用于核因子-κB（NF-κB），使致炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α等的基因表达、释放增加，这些细胞因子可介导炎症反应，加重肝细胞损伤［17］。单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）是单核细胞家族活性最强的趋化因子，在IL-8、TNF-α、LPS等致炎因子的刺激下，由单核细胞、Kupffer细胞等分泌，是诱导免疫细胞参与炎症反应的关键，持续炎症反应，加速病情发展［18-22］。活化后的M1型巨噬细胞会高表达MCP-1，通过NF-κB对M1型巨噬细胞炎症因子表达的调控，从而控制炎症进展［23］。MCP-1含量的测定对进一步探究巨噬细胞的极化表达及水蜈蚣抗肝炎的机制有一定的提示作用。本实验中模型组血清IL-6、TNF-α、MCP-1水平较正常组明显升高，水蜈蚣组和联苯双酯组血清IL-6、TNF-α和MCP-1水平较模型组明显降低，提示水蜈蚣可能通过调节炎症因子水平，减轻炎症反应而改善CCl4所致肝损伤。

本研究表明水蜈蚣水煎液有保肝的作用，现代化学研究表明，水蜈蚣全草中含有黄酮苷、挥发油、有机酸、酚性成分等［7］。已有研究表明中药的黄酮类化合物具有抗炎，提高肝脏组织抗氧化水平，消除自由基的作用，从而达到改善肝组织病理变化，保护肝脏的目的［24］。而水蜈蚣中黄酮类成分是不是保肝作用的物质基础，还需进一步的研究。