地锦草总黄酮对肠源性脓毒症大鼠的肠道保护作用

郑文贺，闫 超

（福建中医药大学附属人民医院，福建福州 350004）

由于仍缺乏有效的治疗方法，目前脓毒症及脓毒性休克患者的病死率仍维持在25%～30%和40%～70%［1-3］。近年来，血必净注射液、参附注射液、姜黄素等药物因具有“抗菌、抗炎、抗毒”的多靶点调节作用，契合了脓毒症时全身性炎症反应网络的复杂失衡，在脓毒症治疗方面得到重视［4-6］。因此，中草药活性成分的抗脓毒症作用值得进一步去探索。地锦草（Eu ph or bia humifusawilld，EH）系大戟科（Euphorbiaceae）大戟属（Eu phorbia L i ma）植物。地锦草中含有槲皮素、没食子酸、没食子酸甲酯、肌醇、黄酮苷类化合物（山奈素苷类，槲皮素苷类）、单宁类化合物等多种活性化合物，具有多种药理作用和生物学活性［7-10］。地锦草经常被用于治疗肠炎、痢疾等肠道疾病，但尚未有研究报道其在肠源性脓毒症中的作用。早期体外实验发现，地锦草总黄酮类化合物具有很强的抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎、调节免疫等作用［11-17］。本研究旨在阐明地锦草总黄酮对肠源性脓毒症大鼠的肠道黏膜屏障的保护作用，为临床预防和治疗肠源性脓毒症提供实验依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 80只健康雄性SPF级SD大鼠，体质量（120±20）g，购于上海市计划生育科学院研究所实验动物经营部，合格证号：20180006022039。

1.2 实验药物 采集福建福州产地的新鲜地锦草全草10 kg，经福建师范大学化学系卢玉栋教授团队，用乙醇浸提法对地锦草总黄酮进行萃取提纯，最终获得30 g地锦草总黄酮黄色粉末，-70℃冷冻保存［17］。精密测量0.8 g地锦草总黄酮粉末，用100 mL注射用水稀释溶解成8 mg/mL的地锦草总黄酮溶液。

1.3 实验试剂 水合氯醛、无水乙醇、乙酸异戊酯（国药集团化学试剂有限公司）；内毒素测定试剂盒（福州新北生化工业有限公司）；TNF-α、IL-1β酶联免疫吸附试验试剂盒（赛默飞生物科技有限公司）；PBS缓冲液、电镜固定液、蛋白酶K、破膜液、DAPI（武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G0002、G1102、G1205、G1204、G1012）。

1.4 实验仪器 小鼠手术平台、加温毯（瑞沃德）；电子称量器（凯丰集团有限公司）；D3024R台式高速冷冻离心机（大龙），JB-P5包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；RM2016病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）；JB-L5冻台（武汉俊杰电子有限公司）；KD-P组织摊片机（浙江省金华市科迪仪器设备有限公司）；DHG-9140A烤箱（上海慧泰仪器制造有限公司）；Quorum K850临界点干燥仪、离子溅射仪IXRF MSP-2S、SU8100扫描电子显微镜HITACHI、Nikon Eclipse C1正置荧光显微镜、Nikon DS-U3成像系统（日本Nikon公司）。

2 实验方法

2.1 分组和处置 采用随机数字表法将大鼠分为空白对照组、脓毒症组、地锦草对照组、地锦草组，每组20只。各组大鼠均用标准的鼠颗粒饲料（茂华生物）自由喂养。地锦草对照组和地锦草组以地锦草总黄酮溶液作为唯一水源自由喂养，持续2周，使每只大鼠的总摄药量均衡；其余2组用注射用水自由喂养。2周后，选择状态良好，体质量增加20 g以上的大鼠进行造模。

2.2 脓毒症模型制备 脓毒症组和地锦草组采用盲肠结扎穿孔术（CLP）建立脓毒症动物模型［18］。用7%水合氯醛溶液（0.01 mL/g）行腹腔注射麻醉后，取上腹部正中1 cm纵切口入腹，找出阑尾，在距阑尾盲端1 cm处结扎，再用18 G注射针头穿刺阑尾盲端3次，挤出绿豆大小粪便，还纳阑尾缝合腹腔。空白对照组和地锦草对照组仅开腹取出阑尾后还纳，不进行结扎和穿孔。各组分别于术后0、4、12 h经腹腔注射无菌生理盐水1.5 mL/kg。选取精神萎靡、毛发稀松、24 h存活的大鼠进一步检测血清内毒素，明显升高者为合格的脓毒症模型。本实验中动物处置方法符合动物伦理学标准。

2.3 动物生存观察与取材 各组分别于术后4、8、16、24 h观察动物的生存状态和累计死亡率。存活的动物于术后24 h，用7%水合氯醛溶液（0.01 mL/g）行腹腔注射麻醉后，先取1 mL注射器经剑突下穿刺心脏，抽取血液2 mL，备用；再开腹，在距阑尾5～10 cm位置的回肠进行标本取材，送检电镜，石蜡切片，以及蛋白检测。

2.4 血清细胞因子及内毒素检测 经心脏穿刺取血，3 000 r/min离心20 min，取血清分装，-70℃保存。采用终点显色法测定各组血清内毒素水平，采用酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清TNF-α和IL-1β含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.5 透射电镜扫描观察回肠黏膜屏障结构变化 距阑尾5～10 cm位置的回肠进行标本取材，立即修剪成1 mm3的组织块，浸入电镜前固定液，固定4 h以上；0.1 mmol/L磷酸缓冲液PB（pH 7.4）漂洗3次，每次10 min；1%锇酸-0.1 mmol/L磷酸缓冲液PB（pH 7.4）固定2 h；乙醇梯度脱水，每次15 min；100%丙酮浸泡2次，每次15 min；丙酮∶812包埋剂＝1∶1，37℃，浸泡2～4 h；丙酮∶812包埋剂＝1∶2，37℃，渗透过夜；纯812包埋剂，37℃，浸泡5 h；包埋后置60℃烤箱聚合48 h，取出树脂块备用。树脂块于超薄切片机，切成60～80 nm超薄切片，捞于150目铜网上。饱和醋酸铀、枸橼酸铅染色；HT7800/HT7700透射电镜下观察拍照。

2.6 TUNEL染色法检测回肠组织细胞凋亡情况石蜡切片脱蜡至水，切片稍甩干后用组化笔在组织周围画圈，在圈内滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃温箱孵育25 min。将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后在圈内滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20 min，将玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。取TUNEL试剂盒内适量试剂1（TdT）和试剂2（dUTP）按1∶9混合，加到圈内覆盖组织，切片平放于湿盒内，37℃恒温箱孵育2 h，湿盒内加少量水保持湿度。切片用PBS（pH 7.4）洗涤3次，每次5 min。去除PBS后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10 min。玻片置于PBS（pH 7.4）中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5 min。切片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。切片于荧光显微镜下观察并采集图像。

2.7 Western Blot法检测Occludin蛋白表达 距阑尾5～10cm位置的回肠进行标本取材，-70℃保存。冰上提取回肠黏膜组织总蛋白，并测定总蛋白质量浓度。每孔加入50μg纯化的蛋白进行SDS-PAGE（12%分离胶）电泳，使用电转移仪于100 V冰浴转印3 h，将蛋白转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温下封闭1 h，加入一抗（1∶150），4℃孵育过夜，PBST（pH 7.4）洗涤3次，每次5 min。然后将PVDF膜转入羊抗兔二抗（1∶100稀释），室温孵育1 h，以β-actin（1∶2 000）抗体作内参。PBST（pH 7.4）洗涤3次，每次5 min。以Image J 1.8.0软件计算目的蛋白与βactin的比值进行比较。

2.8 统计学方法 使用Graphpad Prism 8.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用t检验；计数资料采用χ2检验。

3 结果

3.1 4组大鼠24 h累计死亡情况 空白对照组和地锦草对照组大鼠24 h全部存活，活动自如，毛发光滑，空白对照组粪便呈褐色米粒样，地锦草组呈乳白色糊状。脓毒症组24 h累计死亡率达45%，动物精神萎靡，自主活动丧失，毛发稀松，无光泽，眼角见血性分泌物，粪便呈黑色糊状。地锦草组24 h累计死亡率为25%，动物反应迟钝，自主活动减少，毛发光泽欠佳，眼角无血性分泌物，粪便呈乳白色糊状。具体死亡情况见表1。

表1 4组大鼠24 h累计死亡情况［n（%）］

3.2 4组大鼠血清内毒素、TNF-α和IL-1β的浓度比较见表2。

表2 4组大鼠血清内毒素、TNF-α和IL-1β浓度比较（±s，n＝4）

表2 4组大鼠血清内毒素、TNF-α和IL-1β浓度比较（±s，n＝4）

注：与空白对照组比较，1）P＜0.05；与脓毒症组比较，2）P＜0.05。

IL-1β/（pg/mL）0.385±0.090 27.440±9.2881）0.333±0.126 7.915±1.2931）2）组别空白对照组脓毒症组地锦草对照组地锦草组内毒素/（EU/mL）0.095±0.073 0.378±0.0171）0.073±0.022 0.300±0.0361）2）TNF-a/（pg/mL）1.553±0.332 123.200±34.2501）1.353±0.104 41.100±14.2801）2）

3.3 回肠黏膜细胞凋亡情况 脓毒症组回肠黏膜细胞呈现明显的凋亡现象；而地锦草组细胞凋亡明显减少，接近于对照组。表明地锦草总黄酮预处理能在脓毒症时减少黏膜细胞的凋亡发生，保护小肠黏膜结构的完整性。见图1。

图1 4组回肠黏膜细胞TUNNEL荧光免疫染色图（×200）

3.4 电镜下回肠黏膜屏障结构变化 空白对照组和地锦草对照组回肠黏膜表面的微绒毛排列整齐，长度一致，无脱落、融合等现象；上皮细胞间连接紧密；上皮细胞线粒体形态正常，嵴清晰。脓毒症组肠黏膜表面的微绒毛稀疏，有脱落现象；细胞间紧密连接打开；上皮细胞损伤严重，细胞器结构消失。地锦草组肠黏膜表面微绒毛排列尚整齐；紧密连接仅出现局部的结构模糊；上皮细胞线粒体肿胀，细胞器结构尚存在。表明地锦草总黄酮能保护脓毒症大鼠回肠黏膜的机械屏障功能完整。见图2。

图2 4组大鼠回肠黏膜电镜结构图（×1000）

3.5 4组大鼠回肠黏膜组织Occludin蛋白表达比较见图3。

图3 4组大鼠回肠黏膜组织Occludin蛋白表达比较

4 讨论

肠道是人和动物体内最大的细菌库。本组实验模型在阑尾穿孔后，腹腔内细菌滋生，内毒素经腹膜吸收入血，导致肠源性脓毒症的发生。地锦草具有显著的抗炎等免疫调理作用，能显著降低KKAy小鼠的血清炎症因子（TNF-α，IL-6）及脂肪因子［19］。既往实验表明，地锦草黄酮甙苷类和有机酸类对大肠杆菌、链球菌、炭疽杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌等多种肠道致病菌，均有不同程度的抑制作用［20］。同时前期实验发现，地锦草组和单纯脓毒症组的结肠腔粪便性状截然不同，这可能与地锦草总黄酮调节胃肠道菌群微生态的作用有关。本研究结果显示，脓毒症组血清内毒素、TNF-α和IL-1β水平较空白对照组明显升高（P＜0.05），提示脓毒症造模均成功。地锦草组血清内毒素、TNF-α和IL-1β水平较脓毒症组明显降低（P＜0.05），提示地锦草总黄酮能调节宿主的免疫功能，显著抑制肠源性脓毒症大鼠的全身炎症反应。

生理情况下，肠道细菌不发生移位，依赖于胃肠黏膜机械屏障的完整性、肠道微生态平衡构成的生物屏障，以及健全的宿主免疫防御系统，共同形成的防护网［21］。肠道机械屏障功能障碍，在脓毒症的发生、发展中起到重要作用［22-23］。肠黏膜上皮中的紧密连接（tight junctions，TJ），是维护肠道机械屏障功能最重要的结构［24-25］。当紧密连接蛋白表达减少或结构断裂时，肠黏膜细胞间隙增大，通透性增加。研究已经证实，紧密连接蛋白移位和表达在脓毒症时发生显著变化［26］。Occludin蛋白是紧密连接构成的主要成分，对紧密连接结构和功能的维持具有重要意义［27］。研究表明，肠道致病菌及其毒素可以下调Occludin蛋白表达，破坏紧密连接结构［28］。用乳酸杆菌干预感染大肠埃希菌的小肠上皮细胞，可升高Occludin蛋白和细胞骨架蛋白的表达，使破坏的紧密连接得到修复［29］。本研究结果显示，地锦草组的Occludin蛋白水平明显高于单纯脓毒症组，提示地锦草总黄酮对紧密连接结构有保护作用；小肠电镜检查也进一步支持这一结果。

胃肠道不但是脓毒症的“发源地”，更是脓毒症的“靶器官”。脓毒症时胃肠道有效血流灌注明显减少［30］，大量氧自由基、细胞因子和炎症介质等的作用，是造成肠黏膜损伤屏障功能破坏的主要机制［31］。地锦草总黄酮具有较强的清除氧自由基和羟自由基的抗氧化功能，并呈剂量依赖性［17，32］。在小鼠实验中，它可明显提高血液中超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量［33］，以及血液CAT和GSH-PX活性［34］。实验结果显示，地锦草组回肠细胞的线粒体损伤轻微，细胞凋亡明显减少，这可能与其显著的抗氧化作用有关。

综上所述，地锦草总黄酮可以从调节肠道菌群微生态异常、保护肠道黏膜细胞和细胞间紧密连接构成的肠道屏障功能以及调节宿主免疫功能等方面，多靶点、全方位地对大鼠脓毒症时的肠道屏障进行有效保护，发挥“抗菌、抗炎、抗毒”的多重作用。