基于TLR4／NF-κB信号通路研究甘草泻心汤治疗溃疡性结肠炎大鼠的机制

张建伟，陈桥英，陈 仪

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种原因不明的慢性炎症性肠道疾病，随着社会快速发展、生活方式及饮食结构的改变，在我国的发病率逐年上升，发病率最低估算约为11.60／10000［1］。研究发现TLR4／NF-κB是溃疡性结肠炎的重要信号通路之一，TLR4与炎症和免疫息息相关，NF-κB作为TLR4信号通路下游重要的多功能核转录因子，激活后在机体的炎症、免疫反应、细胞凋亡等过程中起枢纽作用。因此本文旨在通过对TLR4／NF-κB炎症通路的深入研究，探讨甘草泻心汤对UC的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级Wistar雄性大鼠42只，体质量200 g左右，鼠龄8周，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005，饲养在福建中医药大学实验动物中心SPF级实验室。

1.2 实验药物 甘草泻心汤［2］按原方比例：生甘草12g，半夏9g，干姜9g，黄芩9g，黄连3g，人参9g，大枣6g，购于福建中医药大学附属第三人民医院。柳氮磺吡啶肠溶片（上海福达制药有限公司）。

1.3 实验试剂 2，4-二硝基氯苯、水合氯醛（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；无水乙醇、丙酮、冰乙酸（西陇化工股份有限公司）；过氧化氢（国药集团化学试剂有限公司）；液体石蜡、苏木素伊红（北京索莱宝科技有限公司）；硫化钠（天津恒兴化试剂发展有限公司）；无菌PBS缓冲液（美国HyClone公司）；生理盐水（福州海王福药制药有限公司）；白介素-6（IL-6）、IL-8 ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）；IL-10 ELISA试剂盒（美国R＆D公司）；NF-κB p65（Ab-536）Antibody、TLR4 Antibody（美国Signalway Antibody）。

1.4 实验仪器 RM2135切片机、LeicaDM400B显微图像采集系统、生物显微镜（德国Leica公司）；64R型低温高速离心机（美国BECKMAN公司）；TB-718E生物组织自动包埋机（湖北泰维医疗科技实业有限公司）；ZT-12JI生物组织自动脱水机、YT-7FB生物组织摊烤片机（亚光医用电子技术研究所）；ELx800全自动酶标仪（美国BioTek公司）。

2 方法

2.1 分组与造模 42只Wistar大鼠适应性饲养1周后随机分为空白组、模型组、西药组、甘草泻心汤低剂量组（低剂量组）、甘草泻心汤中剂量组（中剂量组）、甘草泻心汤高剂量组（高剂量组），每组各7只。除空白组外，其他各组参照江学良复合法并稍加改进［3］，用2，4-二硝基氯苯和醋酸复合法建立大鼠UC模型。操作：颈背部用6%Na2S脱毛，每日用2%的2，4-二硝基氯苯丙酮液滴背1次，每次0.3mL，连续14 d。第15天用润滑后直径约3mm的尼龙导管经肛门插入结肠约8cm处，注入0.04mmol／L（0.1%）的2，4-二硝基氯苯乙醇液（50%）0.25mL，第16天注入8%醋酸溶液2mL，精确定时15 s后，用5mL生理盐水冲洗。造模完成后常规饮食，不予任何干预，观察2 d。空白组造模前后均常规饮食，不给予任何干预。

2.2 干预 造模后第3天开始给药，连续14 d，各治疗组均以相应药物灌胃。按照《中药药理研究方法学》［4］计算，成人体质量按60 kg估算，成人向大鼠的用药换算系数为6.17。低、中、高剂量组分别按2.93、5.86、11.72 g／（kg·d）予甘草泻心汤药液灌胃；西药组按0.31 g／（kg·d）予柳氮磺吡啶药液灌胃；空白组不予干预，自由饮食；模型组予同等体积蒸馏水灌胃。各组每日灌胃1次，连续干预14 d。

2.3 取材 灌药观察14 d后，禁食24 h取材，所有大鼠进行腹主动脉取血，分离血清，-20℃低温冰箱保存。取距肛缘8cm处的结肠，沿纵轴剖开观察，剪取病变严重处黏膜组织，生理盐水冲洗干净，10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 结肠组织HE染色 结肠组织蜡块，常规切片，HE染色，显微镜下观察组织形态，拍片留取。

2.4.2 检测指标 采用酶联免疫吸附测定（ELISA）法测定血清炎IL-6、IL-8、IL-10表达水平。免疫组化法分析检测结肠黏膜组织TLR4、NF-κB p65的表达，具体方法和步骤严格按试剂盒说明书操作。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行统计学处理，计量资料以（±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 实验完成情况 模型组大鼠因药物反应死亡1只，高剂量组大鼠因灌胃手法不当，戳穿气管，死亡1只。

3.2 对结肠组织病理形态学的影响 空白组黏膜上皮结构完好、清晰，细胞排列均匀，无明显炎症细胞浸润。模型组黏膜上皮坏死脱落严重，局部糜烂、溃疡，固有层内腺体结构严重破坏，间质充血水肿明显，多数结肠黏膜下层可见大片弥漫性炎症细胞浸润。各治疗组病变均较模型组有所减轻，尤其是高剂量组、西药组与模型组比较，黏膜各层结构更为清晰，黏膜上皮的溃疡或糜烂，间质的充血水肿及下层的炎症细胞浸润都有不同程度的好转。见图1。

图1 6组大鼠结肠组织HE染色病理图（×200）

3.3 6组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表达水平比较 见表1。

表1 6组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表达水平比较（±s）pg／mL

表1 6组大鼠血清IL-6、IL-8、IL-10表达水平比较（±s）pg／mL

注：与空白组比较，1）P＜0.05；与模型组比较，2）P＜0.05；与中剂量组比较，3）P＜0.05。

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组n 767776 IL-68.32±3.5226.86±4.281）3.72±2.991）2）3）5.36±2.652）3）12.85±3.811）2）2.67±0.491）2）3）IL-8119.92±11.45153.92±16.361）99.71±12.181）2）3）123.92±15.782）123.92±6.172）119.03±18.422）IL-1013.38±4.157.71±3.051）7.66±0.671）3）11.44±3.143）17.97±4.831）2）12.28±2.072）3）

3.4 6组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65表达比较 见表2。

表2 6组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65表达比较（±s）

表2 6组大鼠结肠组织TLR4、NF-κB p65表达比较（±s）

注：与空白组比较，1）P＜0.01，2）P＜0.05；与模型组比较，3）P＜0.01。

组别空白组模型组西药组低剂量组中剂量组高剂量组TLR40.137±0.0180.534±0.0251）0.271±0.0291）3）0.268±0.0411）3）0.228±0.0311）3）0.217±0.0633）NF-κB p650.086±0.0160.464±0.061）0.154±0.011）3）0.231±0.0461）3）0.156±0.0161）3）0.127±0.0172）3）

4 讨论

溃疡性结肠炎是一种慢性炎症性疾病，虽然其发病机制尚不清楚，可能与遗传因素以及免疫功能失调密切相关［5］。随着对免疫系统越来越多的深入研究，发现TLRs家族中的TLR4介导的信号转导通路是UC发病过程中的重要环节，NF-κB作为TLR4信号通路下游重要的多功能核转录因子，激活后在机体的炎症、免疫反应、细胞凋亡等过程中起枢纽作用［6-7］。活化的NF-κB可促进IL-6、IL-8等炎症细胞因子大量分泌。这些细胞因子又进一步激活NF-κB，形成正反馈调节，使炎症反应放大［8］。因此调节TLR4／NF-κB信号通路可能是治疗UC的主要靶点［9］。

多数医家认为UC属于中医“痢疾”“泄泻”等疾病范畴，脾胃虚弱、湿热内蕴，寒热错杂、虚实夹杂是其主要病机。甘草泻心汤出自《金匮要略》，由半夏泻心汤重用生甘草化裁而来，方中重用生甘草为君取其清热解毒；黄芩、黄连协助生甘草泻火，燥湿清热；半夏、干姜温中健脾燥湿；人参、大枣补中益气。全方辛开苦降，寒温并用，升清降浊，既使中州得健以扶正，又清热祛湿以祛邪。现代药理研究证明，甘草泻心汤保护消化道黏膜的机制可能是通过调理肠道菌群、抑制炎性信号通路、修复黏膜细胞等作用，从而达到防治消化道黏膜炎症的目的［10］。实验研究发现甘草泻心汤联合西药具有修复UC患者肠黏膜屏障，改善肠黏膜通透性，恢复肠道菌群多样性等方面的作用［11-12］。

本课题实验结果显示，甘草泻心汤能明显改善UC大鼠结肠组织的病理学炎性改变，降低TLR4、NF-κB p65蛋白表达，抑制血清促炎性因子IL-6、IL-8水平，进而上调抗炎细胞因子IL-10水平，表明甘草泻心汤可通过对TLR4／NF-κB炎症信号通路的调节而发挥对UC的治疗作用。其机制可能是通过抑制TLR4活性，以阻止其下游的核转录因子NF-κB的激活，阻碍其信号传递，降低促炎性因子IL-6、IL-8的产生，进而上调抗炎细胞因子IL-10的水平，减少炎症反应，表明甘草泻心汤具备一定程度的抗炎、抗溃疡、保护黏膜、改善水肿充血等作用，从而改善肠道功能，其中甘草泻心汤高剂量组的疗效及各种调节作用较为显著。