迷迭香酸对脂多糖诱导小鼠神经炎症的影响

余 意，陈建雄，管江丽，祁克明，魏艺聪，卢 伟*

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州350122；2.福建中医药大学生物医药研发中心，福建 福州350122）

神经炎症是发生在神经系统的特殊免疫应答，它与许多脑部神经疾病的发展紧密相关，如多发性硬化症、帕金森病、阿尔茨海默病等［1］。神经炎症的发生常常伴随着促炎细胞因子水平的升高［2-3］。小胶质细胞作为中枢神经系统的第一道免疫防线，在免疫异常所诱发的各种神经退行性疾病中发挥着重要作用。小胶质细胞是中枢神经系统主要的固有免疫细胞，也是神经系统中专职的巨噬细胞，负责免疫监控、抗原呈递、吞噬碎片、分泌调节性免疫分子等［4］。而在病理条件下，炎性细胞、巨噬细胞和胶质细胞等会大量表达诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS），从而诱导产生过量的NO，在中枢神经系统引起神经毒性反应，所以iNOS被认为是一种“病理型”的酶［5］。因此，当小胶质细胞受到外界刺激而被激活后，会释放NO等神经毒性物质和各种炎性细胞因子，这些物质往往会引起炎症反应级联放大，若得不到及时清除，最终会造成中枢神经系统退行性疾病［6-8］。迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）系酚酸类化合物，研究表明其具有抗炎、抗氧化、抗病毒、免疫抑制、保护神经元等多种生理活性［9-12］。本研究旨在通过RA干预脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）刺激小鼠及BV2细胞实验，探究RA对LPS诱导小鼠神经炎症的影响以及对BV2炎症反应的影响，以期为RA在新药的开发以及相关疾病的治疗上提供实验数据。

1 实验材料

1.1 实验动物 6～8周的C57BL／6雄性小鼠39只，体质量（22±2）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：CXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室，使用许可证号：SYXK（闽）2014-005。24 h恒温（21～23℃）恒湿（55%～75%），模拟自然昼夜变化（6∶00—18∶00给予光照，其他时间为黑夜状态），自由饮水饮食。

1.2 细胞株 小鼠小胶质细胞BV2细胞株通过上海复祥生物科技有限公司采购于American Type Tissue Culture Collection（ATCC）。

1.3 实验试剂 迷迭香酸（北京百灵威科技有限公司，纯度≥98%，货号：547770）；脂多糖（美国Sigma公司，货号：L2630）；RPMI-1640培养基、胎牛血清（美国Gibco公司，货号：C11875500BT、10099141）；Penicillin-Streptomycin Solution、Phosphate Buffered Saline（美国Hyclone公司，货号：sv30010、SH30256.01）；iNOS抗体（美国SANTA CRUZ公司，货号：sc-650）；β-actin抗体（北京全式金生物技术有限公司，货号：HC201）；辣根过氧化物酶标记的二抗（北京依玛博科技有限公司，货号：EM35110，EM35111，按1∶20000稀释）；ECL化学发光试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司，货号：P0018A）；一氧化氮测定试剂盒（南京建成生物工程研究所，货号：A013-2-1）；Mouse IL-6 ELISA Kit（武汉博士德生物工程有限公司，货号：EK0411）；Mouse IL-1beta ELISA Kit（上海恪敏生物科技有限公司，货号：EM001-96）。

1.4 实验仪器 Nfinite M200 Pro多功能酶标仪（TECAN）；PowerPac Basic基础电泳仪、ChemiDoc XRS+凝胶成像系统（Bio-rad）；HERACELL 150i细胞培养箱（Thermo Fisher）；SW-CJ-1FD超净工作台（AIRTECH）；Centrifuge5418高速离心机（Eppendorf）；HH-2数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；EX224电子天平（OHAUS）；Carl Zeiss AG激光共聚焦显微镜（Oberkochen，Germany）。

2 实验方法

2.1 干预与造模 C57BL／6小鼠购进适应性喂养1周后，随机分成对照组、LPS组、LPS＋RA低剂量组、LPS＋RA中剂量组、LPS＋RA高剂量组，每组各6只，用于分子指标检测。将RA溶于生理盐水，LPS＋RA低剂量组、LPS＋RA中剂量组、LPS＋RA高剂量组于麻醉前30 min分别按40、60、80mg／kg腹腔注射RA溶液。水合氯醛用生理盐水溶解，按400mg／kg进行腹腔注射麻醉。待小鼠麻醉后，剪开头皮，查找前囱点，以前囱为原点，向后0.2～0.5mm，统一向右旁开1.0～1.5mm切口，深度2.0～3.0mm，以0.1μL／s的速度进行侧脑室注射，LPS给药量为100μg／kg，停针30 s使药物扩散。注射完后缝合切口，并在切口处涂庆大霉素以防止感染，并涂苦味酸防止互咬伤口，放回笼中饲养24 h。断头取脑（去除嗅球、小脑和脑干），放入液氮中保存。研钵高温烘烤灭菌后，将脑组织在研钵里加液氮研成粉末。将粉末按100 mg每管分装到无菌无酶EP管中，放入液氮保存。

2.2 大脑神经细胞形态观察 随机选取9只小鼠，分为对照组、LPS组、LPS＋RA高剂量组，按“2.1”步骤给药，24 h后进行麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，然后用镊子提起心尖将针头插入左心室，剪穿右心耳，缓慢注射生理盐水进行灌流，至肺和肝的颜色都变成灰白色。换用4%的多聚甲醛灌注至小鼠四肢僵硬。断头取脑，置于多聚甲醛固定24 h。进行常规的石蜡包埋，按厚度5μm进行冠状切片，HE染色，光学显微镜下观察神经细胞形态的变化。

2.3 免疫荧光实验 受试脑切片用0.5%Triton X-100室温通透10 min，PBS洗3次，在玻片上滴加3%正常山羊血清，室温下封闭2 h后，加入兔抗iNOS一抗（1∶200），4℃孵育过夜，PBS洗3次，加入FITC标记的二抗，37℃避光孵育60 min PBS洗涤后，滴加3mg／L的DAPI，避光孵育5 min，对标本进行核染，洗去多余的DAPI，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，激光共聚焦显微镜下观察采集图像。

2.4 细胞培养 小鼠小胶质细胞BV2培养于含10%胎牛血清和1%Penicillin-Streptomycin双抗的RPMI-1640培养基中，培养于37℃、5%CO2的培养箱中。当细胞超过80%汇合度时，进行细胞传代培养。按2×105／mL浓度将细胞接种于六孔板中，每孔2mL，培养24h，细胞密度约80%，换含1%胎牛血清含药培养基培养。给药终浓度分别为LPS 100 ng／mL，RA 50、100、200μmol／L，继续培养24 h。

2.5 qPCR检测相关基因表达变化 小心吸去培养液，向每孔中加入RNA Isolater Total RNA Extraction Reagent 1mL提取总RNA，用移液枪吸取液体反复吹打，使细胞能够充分裂解。将充分裂解的溶液小心移入无菌无酶EP管中，按试剂盒方法进行总RNA的提取。GAPDH：上游CAACGGGAAACCCAT CACCA，下游ACGCCAGTAGACTCCACGACAT；CD14：上游AAACTCGCTCAATCTGTCTTTCACT，下游GGG TTCCTATCCAGCCTGTTGT；CD44：上游TGGGTTCA TAGAAGGAAATGTGGTA，下游TGTCATAGTGGGA GGTGTTGGA；MCP-1：上游CCACTCACCTGCTGCT ACTCATT，下游GTATGTCTGGACCCATTCCTTCTTG；MIP-1α：上游GCTCCCAGCCAGGTGTCATTTT，下游AAGACTCTCAGGCATTCAGTTCCAG。用RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒反转录成cDNA，再用SYBR Select Master Mix试剂盒进行qPCR。

2.6 NO浓度测定 收集细胞培养液，再向每孔细胞中加入200μL含PMSF的RIPA裂解液，充分裂解后收集于离心管中。两者经离心后用NO测定试剂盒测定NO浓度。

2.7 Western blot法检测iNOS蛋白表达 小心吸去培养液，向每孔加入150μL含PMSF的RIPA裂解液，反复吹打后离心，取上清。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度，调齐浓度，向样品蛋白中加入适量5×Loading Buffer使混合溶液终浓度为1×。震荡混匀后100℃变性10 min，经电泳、转膜、封闭、孵育一抗（iNOS抗体1:200；β-actin抗体1:1000）、孵育二抗（1:20000）后进行显影，用Image Lab软件进行分析处理，以目的蛋白的灰度和βactin灰度的比值作为目的蛋白的相对表达水平。

2.8 统计学方法 采用SPSS 21.0软件进行数据分析，结果以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 RA对LPS引起小鼠大脑神经细胞形态改变的影响 采用HE染色观察小鼠大脑海马区神经细胞形态的改变。如图中虚框所示，对照组小鼠大脑神经细胞没有明显变化，细胞排列较为紧密整齐，层次较多，细胞核大而圆，核仁明显。LPS组小鼠大脑海马区神经细胞排列稀疏散乱，少量细胞核结构不清晰，呈不规则状，有固缩情况。RA给药组能够明显改善LPS引起的改变，见图1。

3.2 RA对LPS引起小鼠大脑中细胞炎性基因表达的影响 免疫荧光检测结果显示，对照组iNOS表达量很低，LPS组小鼠大脑中海马区中iNOS表达显著增加，而在RA干预后，iNOS的表达明显降低，见图2。qPCR法检测结果显示，LPS单独刺激会增加CD14、CD44、MCP-1与MIP-1αmRNA的表达，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加 的表达，见图3。

图1 小鼠大脑海马区神经细胞HE染色图（×200）

图2 小鼠大脑海马区iNOS免疫荧光图（×200）

图3 RA对LPS诱导小鼠大脑中CD14、CD44、MCP-1和MIP1αmRNA表达影响

3.3 RA对LPS诱导BV2细胞的NO浓度和iNOS蛋白表达的影响 Western blot检测iNOS表达变化情况，正常情况下，iNOS表达量很低，在LPS刺激下表达增加，而在RA干预后，iNOS的表达降低，且呈明显的量效关系，见图4。

图4 RA对LPS诱导BV2细胞的NO浓度和iNOS蛋白表达的影响

3.4 RA对LPS诱导BV2细胞炎症基因表达的影响 结果显示LPS单独刺激会增加CD14、CD44 mRNA的表达，而RA在一定程度上可降低由LPS作用而增加的表达，见图5。

4 讨论

已有研究表明，在正常生理条件下，神经细胞产生的NO在神经系统的信号传递及大脑的学习记忆生理过程中发挥着重要作用。但当神经细胞受刺激而产生和释放过量NO时，过量的NO会引起神经毒性级联反应。过多的NO扩散至细胞外后，激活邻近的突触引起一系列反应使得细胞内钙离子超载引起不良反应，而钙离子超载是造成神经细胞损伤的重要原因之一。此外，过多的NO能抑制神经元和胶质细胞膜上的谷氨酸转运体，致使谷氨酸在神经元外滞留，从而引起神经元的谷氨酸兴奋性不良反应。过多的NO除了自身有不良反应外，其衍生物特别是过氧硝酸盐能够引起脑部更严重的损害，甚至会导致血脑屏障破坏［13-14］。在NOS中，iNOS是神经细胞受刺激损伤后产生过量NO的主要诱导酶，在神经炎症状态，大脑中的小胶质细胞和星性胶质细胞中iNOS的表达显著提高，因此，iNOS常作为神经炎症的标志物。已有研究表明，iNOS可调控CD14和CD44的表达，而CD14是一类具有比较广泛配体特异性和模式识别功能的受体，能够识别多种微生物产物特别是LPS并引起炎症反应，CD44是透明质酸的主要受体，CD44与透明质酸的相互作用在炎症过程中起重要的作用，CD14和CD44的扩大表达可导致炎症的级联反应，在神经炎性损伤中具有重要作用［15-17］。另外，MCP-1与MIP-1α等趋化因子等炎症介质，导致炎性细胞的聚集，浸润的炎性细胞进一步释放这些细胞因子和趋化因子，引起神经胶质细胞的进一步活化，从而产生炎症信号级联扩大反应，释放各种细胞毒性成分，导致神经细胞的损伤。因此，发现及研发抑制iNOS过量表达的药物，对治疗NO引起的神经损伤及脑部疾病具有重要意义。

图5 迷迭香酸对LPS诱导BV2细胞的CD14和CD44 mRNA表达的影响

神经炎症具有双向调节作用，一方面在维持机体稳态方面起着重要作用；另一方面当反应过度时，则会损伤脑部神经及器官。本研究利用侧脑室注射LPS（100μg／kg）建立神经炎症小鼠模型，给迷迭香酸（40、60、80mg／kg）治疗后，迷迭香酸能够改善LPS诱导的小鼠神经炎症，并且在体内与体外实验均表明迷迭香酸可有效抑制神经炎症。本研究显示迷迭香酸对脂多糖诱导的小鼠神经炎症具有明显的改善作用，表明迷迭香酸对神经炎症相关疾病的预防和治疗方面具有重要的研究价值。