当归芍药散加味方对乳腺增生大鼠sFas及Fas／FasL表达的影响

张婷婷，王 苹，张建伟

（福建中医药大学中医学院，福建 福州350122）

当归芍药散出自《金匮要略方论》，由当归、芍药、川芎、茯苓、白术、泽泻组成，全方从肝脾入手，意在使肝气条达，脾气健运，肝脾同调，气血两和，虚实兼顾，为调和肝脾类方之祖，又有气血湿（痰）同治之妙。通过前期的研究基础表明，乳腺增生病各证型间凋亡指数和相关凋亡基因的表达有一定的差异性；从肝脾着眼活血散结治疗乳腺增生病在改善临床症状、缩小肿块方面确实有效，并可通过影响乳腺组织上皮细胞增殖和凋亡过程达到一定的干预治疗目的。因此，本实验在前期研究基础上，紧扣乳腺增生病的病机，以乳腺增生模型动物为观察对象，观察当归芍药散加味方对实验动物血清sFas、Bcl-2和乳腺组织Fas、FasL表达的影响，目的在于阐明该方是否通过干预乳腺增生组织Fas／FasL系统来抑制乳腺组织细胞增生，促进细胞凋亡，从而抑制／逆转乳腺增生，降低增生程度，为拓展经方应用范围和经方开发、研制提供一定的科学依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 60只SPF级SD雌性健康未孕大鼠，10周龄，体质量（193.78±5.78）g，购买于上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2017-0005。实验场所福建中医药大学动物实验中心。

1.2 实验药物 当归芍药散加味方组成：当归15g，芍药15g，川芎8g，茯苓10g，白术15g，泽泻10g，浙贝母12g，柴胡8g，香附12g，丹参15g，由福建中医药大学附属第二人民医院药房提供。将生药经蒸馏水浸泡1h，文火煎煮2次，每次60 min，取汁合并，4层纱布过滤2次，70～80℃水浴浓缩为240%浓度的药液（含生药1 g／mL），冰箱储存备用。乳消Ⅲ胶囊溶于生理盐水，由福建中医药大学附属第二人民医院制剂科提供（院内制剂）。

1.3 实验试剂 苯甲酸雌二醇注射液（上海通用药业股份有限公司）；黄体酮注射液（浙江仙琚制药股份公司）；10%水合氯醛溶液、中性树胶、多聚赖氨酸、sFas和Bcl-2 ELISA试剂盒、Fas和FasL SABC试剂盒、PBS缓冲液、苏木素染色液（北京索莱宝科技有限公司）。

2 实验方法

2.1 造模 适应性喂养1周后，随机分为正常对照组12只、实验组48只。实验组采用雌、孕激素序贯法造模，按体质量0.5mg／（kg·d）于大鼠后肢后外侧肌肉注射苯甲酸雌二醇，每日1次，左右交替，连续25 d；继而用黄体酮5mg／（kg·d）注射，每日1次，连续5 d。正常对照组肌肉注射生理盐水0.1mL／只，每日1次，连续30 d。

2.2 分组与干预雌、孕激素联合给药造模完成后，实验组再随机分为模型1组、模型2组、当归芍药散加味方组、乳消Ⅲ胶囊组，每组12只。模型1组，断头处死，取下第二、三对乳房组织，经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋制片后，观察造模是否成功，另外也与实验结束后模型2组进行比较，观察增生的乳腺组织是否存在自我复旧；模型2组与正常对照组大鼠均按1mL／（kg·d）予生理盐水灌胃；当归芍药散加味方组按1 g／（kg·d）予当归芍药散加味方药液灌胃；SD大鼠中剂量是成人剂量的6.25倍，按15粒／（成人·d）计，乳消Ⅲ胶囊组按1.5625粒／（kg·d）予乳消Ⅲ胶囊药液灌胃，每组均连续灌胃30 d。

2.3 标本采集 大鼠灌胃30 d后，禁食24h，通过随机抽取方式，每组随机取8只实验大鼠进行标本采集与指标检测。运用腹腔注射麻醉药的方法，予10%水合氯醛（1mL／kg）麻醉后，腹主动脉取血4mL，加入肝素抗凝，待做血清检测。取血后处死大鼠，经乳头向基底部最大面积取下第二对完整乳房组织，10%福尔马林溶液固定，等待做组织学和免疫组化检测。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 病理学观察 常规取材后，通过固定、脱水、石蜡包埋切片、HE染色，在光学显微镜下对乳腺组织切片进行观察。

2.4.2 ELISA法检测血清sFas、Bcl-2表达 腹主动脉取血4mL加入肝素钠抗凝，混合均匀，1000 r／min后收集血清，置-80℃冰箱储存备用，收集血液的试管及器皿均去热源和内毒素，标本无溶血及絮状沉淀，采用ELISA法检测sFas、Bcl-2，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

2.4.3 免疫组化SABC法检测乳腺上皮组织Fas、FasL表达 取大鼠第二对乳房，用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋切片，HE染色后，应用免疫组化SABC法检测大鼠乳腺组织Fas、FasL阳性表达情况，采用Olympus（BH-2）照相显微镜观察并摄片。

2.5 统计学方法 采用SPSS 18.0统计软件进行数据处理。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用t检验。

3 结果

3.1 大鼠乳腺组织形态学变化 在镜下可见，正常对照组保持静息期状态，主要呈现脂肪族和结缔组织，腺管、腺泡数量、大小均正常；模型1组和模型2组大鼠的乳腺组织与正常对照组比较，乳腺导管上皮出现了明显的增生，乳腺导管扩张，乳腺腺泡及小叶数量增多，部分大的乳腺导管腔内还可以见到部分脱落的上皮细胞或者嗜酸性分泌物，2组乳腺组织无明显差异，说明模型2组在停止造模后没有自愈倾向；当归芍药散加味方组和乳消Ⅲ胶囊组与模型组比较，增生程度均有明显改善，乳腺腺泡和导管上皮增生程度有明显改善，但从显微镜下观察来看2组无明显差异。见图1。

图1 5组大鼠乳腺组织形态学HE染色（×100）

3.2 5组大鼠血清sFas和Bcl-2浓度比较 见表1。

表1 5组大鼠血清sFas和Bcl-2浓度比较（±s） μg／L

表1 5组大鼠血清sFas和Bcl-2浓度比较（±s） μg／L

注：与正常对照组比较，1）P＜0.01；与模型2组比较，2）P＜0.01；与乳消Ⅲ胶囊组比较，3）P＜0.01。

组别正常对照组模型1组模型2组乳消Ⅲ胶囊组当归芍药散加味方组n 88888 sFas 1.06±0.5312.42±3.681）12.63±3.321）6.92±1.421）2）6.07±2.061）2）Bcl-21.01±0.022.09±0.061）2.07±0.061）1.70±0.021）2）1.52±0.021）2）3）

3.3 5组大鼠乳腺组织Fas和FasL蛋白阳性表达率比较 见图2、图3、表2。

4 讨论

乳腺增生病在临床多见女性发病，病程长，反复发作，有一定恶变倾向。临床上本病常见病机有：肝气郁滞、肝郁脾虚、肝肾亏虚、冲任失调，同时也有气滞、痰阻、血瘀等病理变化。中医治疗本病的方式多样，在缓解患者临床症状及降低恶变率方向有良好的作用［1-2］。目前临床治疗有内治法和外治法，内治法紧扣乳腺增生病的发病病机，通过疏肝、健脾、补肾、调补冲任及活血、化痰、散结为大法；外治法包括了针灸、局部乳房按摩、外用膏药敷贴等，均有确切的疗效。

目前中药治疗乳腺增生病多从肝、肾角度入手，以行气、活血、散结为主。本课题组在前期研究发现，本病可从肝脾入手，痰瘀同治，拟定《金匮要略》当归芍药散为主方，加味运用于临床疗效显著，同时还用此方开展了多项动物实验研究，探讨本方治疗乳腺增生病的作用机理。当归芍药散加味方是在原方的基础上加入了柴胡、香附、丹参、浙贝母，既可增强疏肝解郁、理气活血的力度，又能加强化痰散结之功，使得全方更符合乳腺增生病之肝脾失调、痰瘀互结乳络的病机特点。

近几年来，关于本病在动物模型研究方面，①模型动物的选择方面［3］：筛选复制率高、周期短、生存周期长、经济成本合适的实验动物，比如目前常用于实验的动物有SD大鼠、Wistar大鼠、豚鼠、昆明小鼠、新西兰兔等；②中医证型的动物模型复制：如贾敏等［4］运用了复合造模的方法建立了肝郁气滞证的乳腺增生模型大鼠，这种模型塑造更为符合中医的研究特点。

图2 大鼠乳腺组织Fas免疫组化图（×400）

图3 大鼠乳腺组织FasL免疫组化图（×400）

表2 大鼠乳腺组织Fas和FasL蛋白阳性表达率比较（±s）%

表2 大鼠乳腺组织Fas和FasL蛋白阳性表达率比较（±s）%

注：与对照组比较，1）P＜0.01；与模型2组比较，2）P＜0.05；与乳消Ⅲ胶囊组比较，3）P＜0.05。

组别正常对照组模型1组模型2组乳消Ⅲ胶囊组当归芍药散加味方组n 88888 Fas 71.56±14.1133.50±12.681）36.71±11.951）51.71±14.081）2）55.75±16.611）2）3）FasL 46.39±8.1866.96±10.741）67.75±9.351）58.04±6.231）2）56.20±7.161）2）3）

Fas／FasL系统包括了Fas、FasL和sFas三种形式，在人体内适当的表达对机体的平衡稳定发挥重要作用，但若该系统调节失常，则会引发组织增生恶变或者是组织间相互致死。Fas／FasL系统调控主要集中于免疫和肿瘤凋亡相关方面，其调控异常导致了细胞凋亡受抑制，机体的免疫监控机制出现监控失常，肿瘤细胞就出现了逃逸现象，逃避机体的免疫监控［5－6］。我们从近年来的文献报道上看，该系统的研究运用于乳腺疾病方面涉及的多是乳腺癌的相关研究，有乳腺癌的发病机制探讨、预后转归的判断及动物实验研究，部分学者将此通路系统运用于乳腺增生疾病中，但报道相对较少。

我们在前期实验设计中就猜想，当归芍药散加味方在治疗乳腺增生病的作用机制是否通过调控机体内的细胞凋亡来达到治疗本病的作用，所以本实验检测Fas／FasL系统中Fas、FasL、sFas的表达和Bcl-2基因表达。实验结果显示，Fas／FasL系统在正常的大鼠乳腺组织中有表达，其特点是Fas高表达，FasL、sFas表达较低；而复制乳腺增生病模型大鼠体内则是Fas表达降低，FasL、sFas表达增高；经过药物干预后，当归芍药散加味方组在增加Fas在乳腺组织中的表达、降低FasL和sFas的表达优于乳消Ⅲ胶囊组。另外，从Bcl-2表达情况看，在模型组中高表达，通过药物治疗后表达下降。从本实验结果推测，当归芍药散加味方对乳腺增生组织Fas／FasL系统有一定干预作用，通过提高Fas和降低FasL的表达，抑制乳腺组织上皮细胞的增生，促进细胞凋亡，从而达到抑制／逆转乳腺增生的作用。然而本动物实验研究周期相对较短，对于实验结果的表现是否是素体本身内在一系列基因的激化、表达及自我调控的结果，或者在时间上有滞后性，这也有待于进一步的研究。