三叶青地上部分总黄酮提取物制备工艺优化研究

余文静，蔡韦炜，陈 丹，熊朝栋，廖淑彬

（福建中医药大学药学院，福建 福州350122）

三叶青（Tetrastigma hemsleyanumDiels et Gilg）又称三叶崖爬藤，属葡萄科崖爬藤属植物，是我国珍稀中药材，也是福建省特色中草药［1］，具有清热解毒、活血止痛、祛风化痰等功效，民间常用于小儿高热、多种炎症及肝病的治疗［2］，野生三叶青主要分布于我国福建、江西、浙江、台湾、广东等省，文献记载始见于清代吴其濬的《植物名实图考》［3］。近年来，三叶青因其突出的抗肿瘤、保肝和免疫调节等作用已被临床广泛应用［4-6］，人工栽培基地建设已逐渐开展。《湖南省中药材标准》［7］《浙江省中药炮制规范》［8］和《福建省炮制规范》［9］收载了三叶 青药材及饮片，以全草或块根入药。课题组前期研究表明，三叶青组分复杂，主要活性成分为黄酮类和酚酸类；三叶青地上部分及其提取物具有抗炎、解热、镇痛作用，黄酮类成分是其主要的药效物质基础［10-16］。因此，本研究以总黄酮含量为主要评价指标［11，16］，采用单因素试验结合正交试验法，优化三叶青地上部分总黄酮提取物（THAA）提取工艺及大孔吸附树脂纯化工艺，提高三叶青地上部分总黄酮纯化率，为THAA药效物质基础及制剂研究奠定质量稳定的原料药基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司］；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；RE-52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；pH计［赛多利斯科学仪器（北京）有限公司］；离心机（上海安亭科学仪器厂）。

1.2 试剂 异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷对照品（自制，纯度98%）；三叶青藤茎叶（宁化县益珍农业科技有限公司提供，福建中医药大学中药鉴定教研室范世明高级实验师鉴定）；水为纯化水；甲醇、乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 THAA总黄酮含量测定

2.1.1 对照品溶液制备 精密称定干燥至恒重的异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷对照品12.30 mg，置50mL量瓶中，加甲醇适量，超声溶解，放冷，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1mL中含0.2460 mg异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷）。

2.1.2 供试品溶液制备 ①醇提取供试品溶液：精密量取提取液适量，置25mL量瓶，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。②洗脱纯化供试品溶液：精密量取洗脱液适量，置25mL量瓶，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。③THAA供试品溶液：精密称取THAA约20 mg，置25mL量瓶中，用50%甲醇超声溶解并放至室温，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 测定方法 精密吸取供试品溶液2.0mL，置25mL量瓶中，加50%甲醇至6mL，精密加入5%亚硝酸钠溶液1.0mL，摇匀，放置6 min，再精密加入10%硝酸铝溶液1.0mL，摇匀，放置6 min，精密加入4%氢氧化钠试液10.0mL，加水稀释至刻度，摇匀，放置15 min；以50%甲醇同法配制溶液为空白，在500 nm波长处测定吸光度。

2.1.4 标准曲线制备及线性关系考察 分别精密吸取“2.1.1”项下异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL量瓶中，按“2.1.3”项下自“加50%甲醇至6mL”起同法操作显色，测定，以异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷对照品的浓度C为横坐标，吸光度值A为纵坐标，绘制标准曲线。实验结果表明，异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷在9.84～59.04μg／mL范围内呈良好的线性关系，回归方程为A＝1.119×10-2C－2.350×10-3，r＝0.9996。

2.2 提取工艺优化

2.2.1 单因素试验考察设计 实验针对影响三叶青地上部分饮片乙醇回流提取中影响总黄酮含量的主要因素，考察提取溶剂乙醇浓度、料液比、提取时间等关键因素，以总黄酮含量为评价指标，设计单因素试验的水平及固定条件。单因素试验设计见表1。

表1 提取工艺单因素试验设计考察条件

2.2.2 提取溶剂乙醇浓度影响 分别取三叶青地上部分药材粗粉3g，精密称定，共5份，分别用30%、45%、60%、75%、90%乙醇溶液，以1∶25的料液比，加热回流2h，趁热过滤，得滤液。按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量。实验结果表明，黄酮类物质的提取量随乙醇浓度的提高而增加，但乙醇浓度超过75%时黄酮类物质提取量反而下降。提示选择45%、60%、75%作为正交试验设计进一步考察乙醇浓度因素项的三个水平。结果见图1A。

2.2.3 料液比影响 分别取三叶青地上部分药材粗粉3g，精密称定，共5份，分别用1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35的料液比，以75%乙醇，加热回流2h，趁热过滤，得滤液。按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量。实验结果表明，随料液比增高，黄酮类物质的提取量逐渐增高，至1∶30后黄酮类物质的提取量维持在较高水平基本不变。提示选择料液比1∶30及上下各1个水平即1∶25、1∶30、1∶35作为正交试验设计进一步考察料液比因素项的三个水平。结果见图1B。

2.2.4 提取时间影响 分别取三叶青地上部分药材粗粉3g，精密称定，共5份，以1∶25的料液比、75%乙醇，分别加热回流1、1.5、2、2.5、3h，趁热过滤，得滤液。按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量。实验结果表明，提取时间在2 h内，黄酮类物质的提取量随时间增高，2 h后随提取时间延长，黄酮类物质的提取量反而降低。提示选择加热回流时间2 h及上下各1个水平即1.5、2、2.5 h作为正交试验设计进一步考察提取时间因素项的三个水平。结果见图1C。

图1 提取条件影响因素考察结果

2.2.5 正交试验设计 采用L9（34）正交设计表，对提取关键影响因素乙醇浓度（因素A）、料液比（因素B）、提取时间（因素C）、提取次数（因素D）四个因素，以总黄酮含量为评价指标，进一步优化提取工艺。正交试验因素水平见表2。

表2 正交试验因素及水平

2.2.6 提取工艺正交试验结果及分析 分别取三叶青地上部分药材粗粉3g，精密称定，按L9（34）正交表设计方案进行提取实验，“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量。实验结果表明，提取次数和乙醇浓度是影响三叶青地上部分总黄酮提取的主要因素，具有显著性差异。影响因素由大到小顺序为提取次数（D）＞乙醇浓度（A）＞料液比（B）＞提取时间（C）。由极差分析可知，采用60%乙醇和75%乙醇为提取溶剂对总黄酮的提取影响极小，故从节约成本考虑，确定最佳提取工艺组合为A2B1C2D3。结果见表3、表4。

表3 正交设计L9（34）及试验结果

表4 正交试验结果方差分析表

2.2.7 提取工艺验证实验 为验证优选的三叶青地上部分总黄酮提取工艺的稳定性和合理性，按照最佳提取工艺条件分别提取试验3批。实验结果表明，该提取工艺稳定可靠，三叶青地上部分粗提物平均得率19.70%，3批粗提物中总黄酮含量分别为29.21、28.98、28.77mg／g。结果见表5。

表5 3批三叶青地上部分粗提物总黄酮含量测定结果（n＝3）

2.3 大孔吸附树脂纯化工艺优化

2.3.1 上样液制备 称取三叶青地上部分粗提物适量，用水溶解成相应浓度，离心，取上清液作为上样液。

2.3.2 大孔吸附树脂的预处理与再生 预处理，取各型号大孔吸附树脂以2倍体积的95%乙醇浸泡24h，充分溶胀后装于柱中，用95%乙醇洗至流出液加水（1∶5）不浑浊，再改用大量蒸馏水冲洗，洗至无醇味，蒸馏水浸泡备用。

简单再生，用95%乙醇冲洗至流出液无色或不再变浅，然后用蒸馏水冲洗至无醇味，即完成简单再生。

强化再生，在柱内加入高于树脂层10cm的3%～5%盐酸溶液浸泡2～4h，然后用3 BV盐酸溶液通柱，再用蒸馏水洗至接近中性；继续用3%～5%的氢氧化钠溶液浸洗2～4 h；再同上法用3 BV同浓度的氢氧化钠溶液通柱，最后再用蒸馏水清洗至pH值为中性，再用2～3 BV乙醇洗柱，然后用蒸馏水洗去乙醇，即完成强化再生。

2.3.3 大孔吸附树脂静态吸附量及解吸率的考察及选择 分别取预处理后抽滤至不滴水的HPD100、D101、X-5、AB-8、NKA-9、HDP826六种型号大孔吸附树脂各1g，精密称定，分别置于100mL锥形瓶中，加入浓度相同的总黄酮提取液各25mL，恒温振荡24h，使树脂充分吸附，滤过，得滤液1。按下式计算树脂饱和吸附量。

式中，C0为提取液中黄酮浓度（mg／mL），C1为滤液1中黄酮浓度（mg／mL），V1为加入的提取液体积（mL），W为大孔吸附树脂质量（g）。

取充分吸附后的大孔吸附树脂，吸干表面后，分别置于100mL锥形瓶中，精密加入50mL 95%乙醇，继续恒温振荡24h，使黄酮解吸附，滤过，得滤液2。按下式计算树脂的解吸率。

式中，C2为滤液2中黄酮含量（mg／mL），V2为所加乙醇的体积（mL），Q为树脂吸附黄酮的量（mg），W为大孔吸附树脂质量（g）。

实验结果表明，经大孔吸附树脂静态吸附性能考察，HDP100大孔吸附树脂的吸附量和解吸率最佳。故确定选择HPD100大孔吸附树脂纯化三叶青地上部分总黄酮。结果见表6。

表6 大孔吸附树脂静态吸附性能的考察

2.3.4 动态吸附中水洗量考察 取上样液适量，上样吸附于20mL柱体积经预处理后的树脂柱中，吸附一定时间后，蒸馏水冲洗，流速2 BV／h，每10mL收集一份洗脱液，Molish反应和盐酸-镁粉反应跟踪监测，确定水洗体积为4 BV。

2.3.5 动态吸附中洗脱溶剂选择 取上样液适量，上样吸附于20mL柱体积经预处理后的树脂柱中，吸附一定时间后，蒸馏水冲洗，弃去水洗液，再依次用5 BV的10%、20%、30%、40%、50%、60%乙醇洗脱，解吸附，流速2 BV／h，收集每0.5 BV流出液，按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量，以洗脱液体积为横坐标，总黄酮浓度为纵坐标，绘制洗脱曲线。实验结果表明，40%乙醇能解吸附大部分总黄酮，故选择40%乙醇为最佳洗脱溶剂。结果见图2A。

2.3.6 动态吸附中洗脱剂用量的考察 取上样液适量，上样吸附于20mL柱体积经预处理后的树脂柱中，蒸馏水冲洗，弃去水洗液，再用40%乙醇、流速2 BV／h洗脱，收集0～10.0 BV流出液，按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量，绘制洗脱曲线。实验结果表明，0.5～2.0 BV的40%乙醇洗脱液中，黄酮含量均较高，故确定收集的40%乙醇洗脱液体积为0.5～2.0 BV。结果见图2B。

图2 动态吸附实验考察结果

2.3.7 设计正交试验确定最佳动态吸附条件 为获得总黄酮提取物纯化工艺中的最佳动态吸附条件，通过考察上样浓度、上样流速、上样pH、径高比四个主要因素，各取三个水平设计L9（34）正交试验。试验方案见表7。

表7 正交试验因素水平表

根据L9（34）正交因素水平表试验，总黄酮纯度和得率为评价指标，精密量取一定体积上样液上柱，吸附一定时间后，4 BV蒸馏水洗脱后弃去，40%乙醇洗脱，收集0.5～2.0 BV洗脱液，合并洗脱液，减压浓缩，40℃下真空干燥，得三叶青地上部分总黄酮提取物（THAA）棕色粉末，测定总黄酮纯度，计算总黄酮得率。

综合得分＝0.5×总黄酮含量（%）＋0.5×总黄酮得率（%）。

采用综合评分法对各因素水平进行评价，数据统计分析用正交设计助手ⅡV3.1。正交实验结果表明，各因素对总黄酮纯化的综合评分的影响大小顺序为C（上样液pH）＞D（径高比）＞A（上样液浓度）＞B（上样流速），上样液浓度对结果有显著性影响（P＜0.05），其他影响因影响较小。从节约时间、提高效率等综合考虑，确定THAA最佳纯化工艺为A3B2C1D3，即上样液浓度3mg／mL，上样流速2 BV／h，上样液pH＝3，柱径高比为1∶8。正交试验结果见表8，方差分析结果见表9。

表8 正交设计L9（34）试验结果

表9 方差分析

2.3.8 上样量的考察 取20mL柱体积预处理好的树脂，采用正交试验优选的吸附条件，以每10mL为一流份接收40%乙醇洗脱液，按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定总黄酮含量，以洗脱液体积为横坐标，总黄酮含量为纵坐标，绘制泄露曲线。实验结果表明，当上样体积小于4 BV时，洗脱液中黄酮含量平稳缓慢增加，当上样体积大于5 BV后，洗脱液中黄酮明显增加。提示选择4 BV作为上样量合适。结果见图2C。

2.3.9 树脂重复利用次数考察 试验考察HPD100大孔吸附树脂经简单再生，再上样、洗脱，按“2.1.2”和“2.1.3”项下同法操作测定THAA中总黄酮含量及其总黄酮得率，绘制大孔吸附树脂利用次数-总黄酮含量的变化趋势图。实验结果表明，利用HPD100大孔吸附树脂在优化工艺条件下纯化提取物，经简单再生后重复利用10次以上，纯化的提取物总黄酮含量及总黄酮得率仍保持稳定，为确保产品质量，故暂定本工艺中大孔吸附树脂可重复使用10次。结果见图2D。

2.3.10 纯化工艺验证 取三叶青地上部分粗提物3批，按照优化得到的最佳工艺条件纯化，验证以上工艺的可靠性，制成的3批THAA测定总黄酮含量及总黄酮得率，代入正交试验综合评分公式分析，证明该工艺稳定可行。从三叶青地上部分粗提物制备3批THAA成品，为棕黄色粉末，平均得率为10.77%，折算成从原药材饮片制备THAA成品平均得率为2.12%。结果见表10。

表10 3批样品含量测定结果（n＝3）

3 讨论

实验建立以THAA效应组分群中含量较高的异荭草苷-2"-O-鼠李糖苷为对照的亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法测定样品中总黄酮含量［11，16］，作为THAA制备工艺优化的评价指标。提取溶剂的筛选，曾考察热水提取法，但提出的杂质较多，总黄酮含量远低于醇提法。比较超声提取法，虽然提取效率尚可，但总黄酮含量依然低于回流提取法，综合环境污染性、提取成本等因素，实验选择乙醇回流提取THAA。但随提取溶剂乙醇浓度的提高，黄酮类成分提取量增加的同时脂溶性物质溶出也增加，冷却至室温时产生的大量沉淀包裹黄酮类成分，不利于进一步纯化，其中叶绿素等色素还对比色法测定产生干扰，故选择的乙醇浓度不宜过高。

经药材饮片粉碎度考察，实验中饮片粉碎后如果不能全部通过二号筛，其中的黄酮类成分提取不完全；如果饮片粉碎后全部通过五号筛，粉末过细，提取过程易产生爆沸且易糊化，影响提取过程的安全性及黄酮类成分的溶出。故最终选择饮片粉碎度为粗粉，即能全部通过二号筛，但混有能通过四号筛不超过40%的饮片粉末。由于三叶青地上部分饮片蓬松，吸收溶剂后明显膨胀。为使其充分浸泡于提取溶剂中，考察料液比参数选择在1∶15～1∶35的范围。

研究从6种大孔吸附树脂中筛选出对三叶青地上部分主体黄酮类化合物吸附和解吸附能力最佳的纯化用大孔吸附树脂HPD-100。三叶青地上部分粗提物黄酮类物质含量较低，其中部分水溶性较差或吸附性较差，静态吸附率较低，动态吸附中可能较快超过泄露点，故上样液总黄酮浓度一般配制3mg／mL左右，可考察的浓度范围较窄。影响大孔吸附树脂分离纯化的因素包括上样浓度、上样流速、上样液pH、径高比等，且各因素间存在交叉影响，故试验采用此4个主要因素，各取3个水平设计正交试验，优化并获得THAA的最佳纯化工艺。采用最佳工艺制备的三叶青地上部分提取物THAA总黄酮含量均达60%以上，且制备工艺具有良好的稳定性和重复性，为THAA药效物质基础及进一步开发健康制品奠定了基础。