UPLC-MS／MS法同时测定鼠曲草中的5个黄酮类化合物

苏艺萍，李 煌*，褚克丹，吴文晞，叶向丽

（1.福建中医药大学药学院，福建 福州350122；2.福建恒正检测技术有限公司，福建 福州350100；3.福建医科大学附属协和医院，福建 福州350001）

鼠曲草为菊科植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥全草，味甘微酸，有化痰止咳、祛风除湿的功效［1］。现代研究表明，鼠曲草中含有黄酮类、氨基酸和挥发油等成分［2］，其中黄酮类含量丰富，是主要的活性成分，目前已经从鼠曲草中分离得到的黄酮类化合物超过30种［3］。现有文献显示，黄酮类化合物具有多种药理作用，如芦丁、芹菜素和山奈酚具有抗炎、抗氧化等生物活性，木犀草素和金丝桃苷还有抗肿瘤作用［4-7］。目前，已有应用高效液相色谱法测定鼠曲草黄酮类成分含量的相关研究报道［8-10］，但有些成分含量较低，成分间较难分离，因此对其进行含量测定需要优化方法，提高灵敏度。液相色谱-串联质谱法（LC-MS／MS）对分离度要求较低，且灵敏度高，能快速完成含量测定，如今也逐步应用于中药成分分析当中［11-12］。因此，本研究建立了同时测定鼠曲草中的5个黄酮类成分（芦丁、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚）含量的超高效液相色谱串联质谱法（UPLC-MS／MS），能满足中药多指标质量评价要求，可为监测鼠曲草的质量提供参考依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Nexera X2超高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SCIEX QTRAP 4500三重四极杆质谱（美国SCI EX公司）；XS105DU型十万分之一分析天平（美国梅特勒-托利多公司）；KQ-500DE数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FY135型中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。

1.2 试药 6批鼠曲草分别产自安徽亳州、广西桂林、云南曲靖、福建宁德、浙江温州和四川泸州，经福建中医药大学药学院黄泽豪教授鉴定为菊科植物鼠曲草（Gnaphalium affineD.Don）的干燥茎叶，样本存放于福建中医药大学药学院中药应用开发研究室，鼠曲草药材粉碎备用。对照品木犀草素（美国MACK公司）；金丝桃苷、山奈酚（成都曼斯特生物科技有限公司）；芦丁、芹菜素（上海源叶生物科技有限公司）。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液 精密称取鼠曲草药材粉末2 g于250mL的具塞锥形瓶中，加入60%乙醇80mL，密封称定质量，超声提取（300W，40 kHz）30 min，冷却后以60%乙醇补足减失重量后过滤，滤渣再加入60%乙醇40mL，重复上述操作提取，合并2次滤液，5000 r／min下离心10 min，取上清液过0.22μm微孔滤膜，即得供试品溶液。供试品稀释液（100倍）：吸取100μL供试品溶液至10mL量瓶，用超纯水定容，摇匀，过0.22μm微孔滤膜即得。

2.1.2 对照品溶液 取芦丁、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚的对照品适量，精密称定，加入甲醇制成质量浓度分别为1.330、1.040、1.540、1.240、1.000mg／mL的单一对照品储备液；分别量取上述各化合物对照品储备液75.2、96.2、65.0、80.6、100.0μL，置10mL量瓶中，加入20%甲醇水至刻度，即得5个化合物质量浓度均为10μg／mL的混合对照品储备液，其他不同质量浓度的对照品溶液由混合对照品储备液逐级稀释，即得。

2.2 色谱及质谱条件

2.2.1 色谱条件 采用Kinnetex C18（2.1mm×100mm，2.6μm）色谱柱，以流动相乙腈（A）-0.1%氨水（B），梯度洗脱（0～0.5 min，10%A；0.5～2.0 min，10%A→95%A；2.0～5.0 min，95%A；5.0～5.3 min，95%A→10%A；5.3～7.0 min，10%A），流速0.25mL／min，柱温40℃，进样量2μL。

2.2.2 质谱条件 采用电喷雾（ESI）离子源的负离子模式，毛细管电压为3.50 kV，脱溶剂气流为氮气800 L／h，脱溶剂温度500℃，锥孔气流：氮气150 L／h，离子源温度：150℃，二级锥孔萃取电压：3.00 V，碰撞气体：氩气，扫描方式为多反应监测（MRM）模式，5个成分的质谱分析参数见表1。

表1 5个成分的质谱分析参数

2.3 UPLC-MS／MS定量方法学考察

2.3.1 专属性 精密吸取混合对照品溶液和供试品稀释液（100倍）适量，按“2.1”项下色谱、质谱条件进样测定，结果显示，5个黄酮成分间分离良好，未有杂质干扰，供试品稀释液和对照品的质谱图两者一致（图1），表明本法专属性良好。

图1 混合对照品（A）和供试品（B）的UPLC-MS／MS色谱图

2.3.2 线性和范围 取“2.2.2”项下各对照品储备液适量，用20%甲醇稀释为5、10、20、50、80、100、150、200和500 ng／mL的混合对照品溶液，按照“2.1”项下的色谱、质谱条件，进样分析。以定量离子峰面积（y）为纵坐标，对照品溶液质量浓度（x）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程和相关系数（r），结果见表2。

表2 各成分线性方程、线性范围和相关系数

2.3.3 精密度试验 取0.10μg／mL的混合对照品溶液，连续进样6次进行峰面积测定（测定条件同“2.1”项下），测定结果显示，芦丁、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚5个黄酮类成分的峰面积RSD分别为2.0%、1.7%、0.82%、1.3%、2.3%，表明仪器的精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取0.10μg／mL的混合对照品溶液，在0、2、6、10、12和24 h测定和在不同日期（3 d内的同一时间）测定，除了山奈酚只在6 h内稳定以外，其他成分的日内RSD均小于3.0%，日间RSD均小于5%；另取处理后的供试品溶液，在1日内的0、2、6、10、12和24 h测定，5种成分的RSD均小于5%，表明供试品溶液在24 h内相对稳定，能满足定量分析要求。

2.3.5 重复性试验 精密称取同一批鼠曲草样品（产地：安徽亳州）6份，制备方法同“2.2.1”项下，条件同“2.1”项下，进样测定，结果芦丁、金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚的平均含量分别为8.10、126.00、511.20、217.80、3.00μg／g，RSD分别为2.3%、1.9%、1.5%、1.8%、2.8%，表明本方法重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 精密称取6份鼠曲草样品（产地：安徽亳州），每份约1g，分别加入折算质量为本底量100%的混合对照品溶液，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进行加样回收试验，记录峰面积并计算各成分的加样回收率。结果显示，5个黄酮类成分的平均回收率98.93%～100.1%，RSD为0.56%～2.2%（n＝6），表明该方法的准确度较好，见表3。

表3 5个黄酮类成分的回收率及RSD（n＝6）

2.3.7 样品含量测定 精密称取鼠曲草样品，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下条件测定峰面积，根据标准曲线计算其含量。结果显示6批鼠曲草的5个化学成分的含量波动明显，说明这6批鼠曲草产地不同，质量存在差异性，见表4。

3 讨论

3.1 基质效应的考察 本研究在样品前处理后，通过加内标考察了基质效应［13］，由测得的浓度计算含量，再对应加标的量来计算基质效应，结果发现，虽然基质对测定的5个成分有一定的抑制作用，但抑制效应较小（均小于10%），可能是由于样品是在稀释了较大倍数后再进样检测，所以基质对于所测定成分的定量影响并不大，因此可以不考虑基质效应对本方法定量的影响。

表4 不同产地6批样品的5个成分的平均含量（n＝3） μg／g

3.2 标准曲线及样品稀释倍数 金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚4种对照品在浓度达到0.15μg／mL时，响应较差，因此标准曲线最大浓度选择为0.10μg／mL。通过预试，金丝桃苷、木犀草素、芹菜素和山奈酚4个黄酮成分在样品中的含量较高，而芦丁含量低，为了使测定结果在线性范围内，最终确定将样品稀释100倍后进样测定上述4个黄酮成分，而芦丁含量的测定则选择“2.2.1”项下未稀释的供试品溶液。

3.3 提取条件的考量 对比超声提取和回流提取两种方法，对于本研究中的5个成分，结果显示差异并不明显，考虑到经济和效率因素，决定采用超声提取法。另外，比较甲醇和乙醇提取及其不同纯度、提取倍量的效果，结果表明60%乙醇作为提取溶剂，提取倍量为60倍时提取效果最佳。在确定了提取溶剂与体积后，本研究进一步考察了提取次数和提取时间对实验结果的影响，结果显示，鼠曲草的最佳提取条件为料液比1∶60、采用60%乙醇超声提取30 min，提取2次。

3.4 色谱条件的选择 分别考察了Kinnetex C18色谱柱（2.1mm×100mm，2.6μm）、Shim-pack XR-ODSⅢ色谱柱（2.0mm×75mm，1.6μm）、Thermo C18（2.1mm×150mm，2μm）和Agilent Zorbax C18（100mm×2.1mm，2μm）、Waters Cortecs C18（2.1mm×100mm，1.6μm）对鼠曲草5个成分的分离效果，结果表明Kinnetex C18色谱柱（2.1mm×100mm，2.6μm）的分离度和灵敏度比其他色谱柱高。先后考察了4种流动相系统（乙腈-0.1%氨水、乙腈-水、甲醇-0.1%氨水、甲醇-水），结果乙腈-0.1%氨水最佳，仅仅7 min即实现了鼠曲草中5个成分的分离定量，单针样品所消耗的流动相不足2mL，明显优于高效液相色谱法。

3.5 质谱条件的选择 本实验综合考察了5个黄酮类成分在正、负离子模式下的响应情况，结果显示负离子模式响应较好，因此选择该监测模式。通过优化每个化合物的MRM条件，从而挑选出最佳的定量离子对。实验选择2对高离子丰度、低基线噪声的离子对用以定性，选择最高离子丰度的离子对用以定量；并在此基础上，对影响灵敏度较大的碰撞能量和源内碎裂电压进行逐个优化，使所选的子离子组成的特征离子达到最佳的丰度和比例。

本实验研究了6批不同产地鼠曲草，所含的5个黄酮类化合物含量虽存在一定差异，尝试从经纬度、气候等方面进行分析，但并未发现明显规律性，这提示这种含量差异可能是由产地、采收时间、加工和储藏方式等多因素综合影响所造成的，而本研究仅测定了少数几个产地样品，后续可增加样本量，并对可能影响含量的其他因素进行更深入的研究。本实验建立超高效液相色谱串联质谱法，测定鼠曲草药材中5个黄酮类成分，为鼠曲草药材成分全面质量评价提供了一种快速、高效的分析方法，为综合评价鼠曲草药材质量提供参考。