益肾降浊冲剂对慢性肾衰竭大鼠肾脏Fas、FasL表达的影响

詹倩倩，郑敏麟

（福建中医药大学中西医结合学院，福建 福州350122）

“培土制水法”复方益肾降浊冲剂，作为治疗慢性肾衰竭（chronic renal failure，CRF）的院内制剂在福建省中医药大学附属人民医院使用已有近20年的历史，其可有效降低CRF患者血清血尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平，改善临床症状，延缓肾衰竭的进展，疗效确切［1-3］。研究表明，益肾降浊冲剂能减轻CRF肾小管间质的损伤，其机制与纠正脂质代谢紊乱、减轻肾内脂质蓄积、减少细胞凋亡有关［4］。本课题组前期研究显示，益肾降浊冲剂治疗CRF作用机制可能通过提高线粒体呼吸功能和减少自由基ROS的产生，来抑制ROS介导的依赖经典Caspase的线粒体凋亡通路，并通过调节肾组织细胞淋巴瘤／白血病-2基因（Bcl-2）和促凋亡蛋白Bcl-2相关X蛋白（Bax）的表达来减缓肾细胞凋亡，从而保护肾脏［5-7］。本研究在此基础上，通过应用益肾降浊冲剂干预5／6肾大部分切除模型大鼠，进一步观察其减少CRF大鼠细胞凋亡，延缓疾病进展的作用机制。

1 实验材料

1.1 实验动物 SPF级4周龄SD大鼠72只，雌雄各半，体质量180～200g，购自上海史莱克实验动物中心，实验动物许可证号：SCXK（沪）2017-0005，合格证编号：20170005005915。饲养于福建中医药大学实验动物中心，饲养于自然光条件，温度（22±2）℃，相对湿度（55±2）%，自由摄食饮水。

1.2 实验药物 益肾降浊冲剂组成：白术15g，茯苓15g，玉竹15g，当归15g，生黄芪30g，太子参15g，桑葚15g，六月雪15g，车前子15g，桑寄生15g，怀牛膝15g，丹参15g，山楂15g，陈皮15g，大黄15g，由福建省第三人民医院中药房提供，常规方法煎煮药液2次（大火煮开后，再用小火煮30 min），水煎并浓缩至每10mL药液中含生药9、18、36g，分别配成低、中、高剂量的水煎剂。大黄素由北京索莱宝科技有限公司提供。

1.3 实验试剂 Fas、FasL抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；DAB染色试剂盒、免疫组化二抗试剂盒（福州迈新生物技术有限公司）；BUN、Scr检测试剂盒（长春汇力有限公司）。

1.4 实验仪器 石蜡切片机（德国Leica公司）；酶标仪（美国BioTek公司）；台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；生物组织摊烤片机（湖北孝感亚光医用电子技术有限公司）；倒置显微镜（日本Nikon公司）。

2 实验方法

2.1 分组与造模 72只SD大鼠，雌雄分笼适应性喂养1周后，随机选取60只作为手术组。手术组大鼠采用20%乌拉坦麻醉，以腹卧位对大鼠左背部手术区进行去毛，沿左沿肋脊角做约2.0cm斜切口，钝性分离肌肉层，充分暴露左肾，迅速切除左肾皮质的2／3，纱布按压止血，复位缝合，1周后切除右肾。手术完成后，按体质量分层随机分为模型组、大黄素组、益肾降浊冲剂高剂量组（简称高剂量组）、益肾降浊冲剂中剂量组（简称中剂量组）、益肾降浊冲剂低剂量组（简称低剂量组），每组各10只（除去术中、术后死亡的10只大鼠），雌雄分笼饲养。将剩下的12只大鼠随机抽取10只作为假手术组。假手术组以同样手术操作进行，但不切肾脏。

2.2 干预 手术4周后开始灌胃，大黄素组大鼠按500mg／（kg·d）予大黄素水溶液灌胃，高、中、低剂量组大鼠分别按36、18、9 g／（kg·d）予益肾降浊冲剂药液灌胃，模型组与假手术组给予同等体积蒸馏水灌胃，每日灌胃1次，连续给药8周。于干预8周后取材，采血备做肾功能检查，并取肾皮质组织放入甲醛水溶液中固定，备做石蜡切片进行免疫组化检测。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 血清BUN、Scr含量检测 经腹主动脉采血，4500 r／min离心15 min，取上清液，按照BUN、Scr试剂盒说明书配制工作液，通过酶标仪检测吸光度。

2.3.2 肾脏组织Fas、FasL免疫组织化学染色 取石蜡包埋好的肾皮质组织，切片，二甲苯脱蜡40 min，100%、95%、80%、70%梯度酒精依次脱水，放于柠檬酸缓冲液中微波修复20 min，冷却至室温后，PBS清洗，滴加过氧化氢室温孵育10 min，PBS清洗，滴加山羊血清37℃下孵育60 min，滴加一抗，4℃孵育过夜，PBS清洗，滴加二抗，孵育30 min后，PBS清洗，随后DAB显色，显微镜下观察显色程度，自来水冲洗，苏木素染核30 s，盐酸酒精分化1 s，流水返蓝15 min，中性树脂封片。每组切片选取3个视野，采用Image-Pro Plus 6.0分析Fas、FasL的表达。

2.4 统计学方法 应用SPSS 25.0软件进行统计学分析。计量资料符合正态分布以（±s）表示，采用单因素方差分析。

3 结果

3.1 6组大鼠血清Scr、BUN含量比较 见表1。

表1 6组大鼠血清Scr、BUN含量比较（±s）

表1 6组大鼠血清Scr、BUN含量比较（±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.05，3）P＜0.01；与大黄素组比较，4）P＜0.05。

BUN／（μmol／L）23.20±3.9647.21±5.831）41.44±6.432）41.13±3.452）39.38±7.073）36.21±2.963）4）组别假手术组模型组大黄素组低剂量组中剂量组高剂量组n 101010101010 Scr／（mg／dL）71.89±13.61141.96±41.051）119.73±17.302）120.70±22.512）99.32±12.293）88.13±14.013）4）

3.2 6组大鼠肾组织Fas、FasL蛋白表达比较 免疫组化结果显示，Fas、FasL蛋白主要在肾小管上皮细胞中表达，位于胞浆，呈淡黄色或棕色的阳性表达。结果见图1～2、表2。

图1 6组大鼠肾组织Fas蛋白免疫组化图（×200）

4 讨论

现代中医学者对于CRF中医病因病机的认识趋于统一，多认为CRF属本虚标实之证，本虚者乃脾肾亏虚，标实则为湿浊、瘀血、痰浊及毒邪为主［8］。阮诗玮教授根据长期临床治疗CRF总结的经验，认为CRF患者多有食少纳呆、倦怠乏力等脾虚症状，补肾药多滋腻，使食欲减退（伤脾），造成药物和营养吸收率更低，进一步加重病情。

图2 6组大鼠肾组织FasL蛋白免疫组化图（×200）

表2 6组大鼠肾组织Fas、FasL蛋白表达比较（±s）

表2 6组大鼠肾组织Fas、FasL蛋白表达比较（±s）

注：与假手术组比较，1）P＜0.01；与模型组比较，2）P＜0.01；与大黄素组比较，3）P＜0.05。

FasL 2094.54±412.6521977.77±2286.171）5068.99±1470.952）14767.67±3047.142）9482.23±913.912）4856.92±543.732）3）组别假手术组模型组大黄素组低剂量组中剂量组高剂量组n 333333 Fas 3170.63±358.1318563.27±2112.991）6128.17±668.162）13396.00±1403.462）8031.80±708.762）5074.53±299.872）3）

阮教授根据中医“脾制水”和“后天养先天”的理论，创立了“培土制水法”益肾降浊冲剂。方中重用生黄芪、太子参、白术、茯苓健脾益气为君；以玉竹、当归、桑葚益脾阴，以陈皮、山楂、丹参理脾运，以大黄、六月雪、车前子泄脾浊，共为臣药；同时，精选桑葚、桑寄生、怀牛膝、当归四味药补肾而不滋腻之药，量小为佐使［6］；全方共奏健脾益肾、培土制水、祛瘀泄浊之功。循证医学研究表明，大黄治疗慢性肾功能衰竭可减少血Scr、BUN，纠正贫血和营养不良，缓解临床症状［9］；大黄及大黄有效成分大黄素、大黄酸均能在肾脏细胞凋亡中起到一定的作用［10-11］。因此，本实验将大黄素组作为对照组。

BUN和Scr是临床病理学中检测肾功能最常用的指标，能够在一定程度上反应肾小球的滤过功能。本研究结果显示，与正常组相比，模型组大鼠血清Scr、BUN水平显著增加，提示模型组大鼠慢性肾衰竭造模成功。与模型组相比，高、中、低剂量组大鼠血清Scr、BUN水平明显下降，提示益肾降浊冲剂干预能明显改善CRF大鼠肾功能，提高肾小球滤过率，延缓肾衰进展，其中高剂量组治疗效果优于大黄素组。

Fas（Apo-1／CD95）是一种Ⅰ型膜蛋白，属于肿瘤坏死因子（TNF）／神经生长因子受体家族；Fas L是一种Ⅱ型膜蛋白，它也是肿瘤坏死因子TNF家族的一员［12］。TNF受体家族的死亡受体，包括肿瘤坏死因子受体、TNF相关的凋亡诱导配体受体和Fas介导的相关凋亡通路。在死亡受体介导的外源性途径中，膜配体（Fas L）与细胞死亡受体（Fas）结合，通过死亡诱导信号复合物传递凋亡信号，诱导Caspase的激活，最终导致细胞凋亡［13-15］。

本研究结果显示，与正常组相比，模型组肾组织中Fas、Fas L蛋白表达水平显著增加，高、中、低剂量组和大黄素组大鼠肾组织Fas、Fas L蛋白表达明显下降，提示益肾降浊冲剂可通过下调肾组织Fas、Fas L的表达来减少CRF大鼠肾细胞凋亡，慢性肾衰进展得到减缓，其中高剂量组治疗效果优于大黄素组。

综上所述，益肾降浊冲剂能降低大鼠血清Scr、BUN水平，改善肾功能，其作用机制可能是通过Fas介导的C aspase凋亡途径，减少肾组织Fas、Fas L的表达，来减缓肾细胞凋亡，从而延缓慢肾衰进程。