基于Wnt／β-catenin信号通路探讨阳和汤对兔膝骨关节炎的影响

黄泽灵 ，何俊君 ，施珊妮 ，洪振强 ，2*

（1.福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122；2.中医骨伤及运动康复教育部重点实验室，福建 福州 350122）

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是最常见的关节退行性疾病，临床表现以缓慢性关节疼痛、肿大、僵硬伴关节功能障碍为主。OA除了软骨的损伤和退变外，还与滑膜炎症、关节骨重塑、骨赘形成以及关节周围肌力减弱等有关［1］。上述病变由不同分子组成的复杂信号网络来调节，其中包括Wnt／β-catenin信号通路，该通路在OA中被激活，可以调节关节软骨的成熟、软骨外基质分解代谢等，对Wnt／βcatenin通路的调控成为OA的治疗靶标［2］。近年来，阳和汤在治疗膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）的临床运用中取得了良好疗效［3-5］，研究表明阳和汤能抑制软骨细胞凋亡，减少软骨外基质破坏，减少炎症因子表达，从而延缓OA进展［6-8］，但具体机制仍未明确。本研究通过关节腔注射木瓜蛋白酶建立兔KOA模型，并予阳和汤干预，观察其对炎症反应、Wnt／β-catenin信号通路及软骨组织的影响，探讨阳和汤防治OA的作用机制，为临床使用阳和汤治疗KOA提供理论依据。

1 实验材料

1.1 实验动物 4～6月龄健康新西兰大白兔24只，体质量2.0～2.5 kg，雌雄各半，购于上海市松江区松联实验动物场，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0008。委托福建中医药大学实验动物中心［SYXK（闽）2014-0006］代购并饲养。

1.2 实验药物 阳和汤药物组成：熟地黄30 g，肉桂 3 g，麻黄 2 g，鹿角胶 9 g，白芥子 6 g，姜炭 2 g，生甘草3 g，购于福建中医药大学附属第三人民医院；西乐葆（辉瑞制药有限公司）。

1.3 主要试剂及仪器 木瓜蛋白酶（美国Sigma公司）；HE染色试剂盒（北京索莱宝科技有限公司）；即用型免疫组化试剂盒（福州迈新生物技术开发有限 公 司 ）；Rabbit Anti-Wnt4 antibody、Rabbit Antiβ-catenin antibody（Proteintech Group）；DAB 显色试剂盒（博士德生物工程有限公司）；ELISA检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）。自动脱水机、石蜡包埋机（孝感亚光医用电子技术有限公司）；石蜡切片机、光镜（德国徕卡公司）。

2 实验方法

2.1 动物分组 将24只4～6月龄健康新西兰兔随机分为空白组、模型组、西乐葆组和阳和汤组，每组6只。

2.2 模型建立 空白组予常规饲养，不予造模；其余3组分别在实验开始的第1、4、7天采用关节腔内注射木瓜蛋白酶进行造模［9-11］，动物麻醉后，膝关节周围备皮消毒，注射0.1 mL木瓜蛋白酶溶液至关节腔，注射后用棉球压住针眼并再次屈伸膝关节使木瓜蛋白酶溶液充分浸润至整个关节腔内。每日强迫动物于空地上活动30 min，分2次进行，连续驱赶4周后可获得OA模型。模型鉴定：进行膝关节Lequesne MG评分［12］，总分≥4分表示造模成功，可纳入进行药物干预。

2.3 药物干预 按成人体表面积与家兔体表面积换算［13］，阳和汤组按 6 g／（kg·d）予阳和汤灌胃，西乐葆组按 24 mg／（kg·d）予西乐葆灌胃，空白组和模型组给予等量生理盐水灌胃，每日1次，连续给药2周。

2.4 标本的采集与制备 停药1周后采集标本，标本采集前各组动物禁食不禁水。腹腔注射10%水合氯醛溶液（3 mL／kg）麻醉动物。行髌骨上缘横向切口，逐层分离至关节囊，屈曲并轻轻挤压膝关节内外侧，用注射器抽取集中在胫骨平台的关节液存入EP管中，迅速投入液氮中保存。取双膝关节股骨髁，清除周边结缔组织，用4%多聚甲醛固定，常规脱钙、包埋和切片。

2.5 检测指标及方法 测量4组干预前后膝关节局部皮温、周径；Lequesne MG评分评估药物干预前后膝关节功能；ELISA法检测关节液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13含量；光镜下观察关节软骨病理改变和进行Mankin's评分［14］；免疫组化检测软骨组织Wnt4、β-catenin表达情况及阳性表达区域积分光密度（IOD）。

2.6 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料以表示，符合正态分布采用单因素方差分析，若方差齐，采用LSD法进行各组间两两比较；若方差不齐，则采用Games-Howell法进行两两比较。非正态分布数据组间比较采用多样本秩和检验进行两两比较。

3 结 果

3.1 4组局部皮温、膝关节周径、Lequesne MG评分比较 见表1。

表1 4组局部皮温、膝关节周径、Lequesne MG评分比较

表1 4组局部皮温、膝关节周径、Lequesne MG评分比较

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组西乐葆组阳和汤组n 6 6 6 6局部皮温／℃36.017±0.172 38.003±0.7691）37.500±0.5021）37.317±0.8891）关节周径／cm 9.917±0.842 12.500±0.5141）11.250±0.3992）11.400±0.3101）2）Lequense MG评分／分0.000±0.000 5.167±0.4081）2.500±1.5171）2）3.000±0.6321）2）

3.2 软骨组织HE染色 空白组软骨表层光滑、平整，软骨细胞分布均匀，序列整齐，层次清晰，软骨细胞无簇集，潮线完整；模型组软骨表面破损严重，基质染色不均，表层软骨细胞丢失，移形层软骨细胞簇集，辐射层、钙化层软骨细胞数量明显减少、排列紊乱；阳和汤组软骨表层较光滑，软骨细胞增多，排列较规则，局部细胞集簇，基质染色尚均匀，潮线完整；西乐葆组软骨表层不平整，可见小缺损，软骨细胞增多，排列尚规则，少量细胞集簇，染色尚均匀，潮线完整，见图1。

3.3 4组关节软骨病理切片Mankin's评分结果见表2。

表2 4组关节软骨病理切片Mankin's评分比较

表2 4组关节软骨病理切片Mankin's评分比较

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组西乐葆组阳和汤组n 6 6 6 6 Mankin's评分0.3±0.51 5.3±1.211）3.0±0.891）2）3.1±1.161）2）

3.4 4组关节软骨中Wnt4、β-catenin的含量比较见表3。

表3 4组软骨组织Wnt4、β-catenin免疫组化 IOD 比较

表3 4组软骨组织Wnt4、β-catenin免疫组化 IOD 比较

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组西乐葆组阳和汤组n 6 6 6 6 Wnt4 622.939±162.435 26079.237±2818.9881）3188.485±530.8651）2）3270.973±866.6761）2）β-catenin 1006.996±119.740 22149.471±4714.0921）3844.582±447.7331）2）3792.487±1213.2651）2）

3.5 4组关节液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比较 见表4。

4 讨 论

OA属中医“痹证”“骨痹”“膝痹”等范畴，阳虚寒凝型是其常见类型［15-17］，其主要病机为禀赋不足或素体阳虚，筋脉失于温煦，寒从中生，或复感风寒湿邪致四肢冷感，遇寒痛增。寒性收引，筋脉收缩挛急，故肢体屈伸不利，若寒邪夹湿，阻滞经络关节，阳气不得布达，则见关节酸痛重着［18］。阳和汤源自清代王洪绪《外科证治全生集》，主治阳虚寒凝证，若痹证日久，外邪蛰伏于筋骨之间，祛邪困难，此时单纯以温里散寒则邪无出路，单纯以开表宣痹则里寒不除，表里不通，经络阻隔，难以取效。阳和汤既用肉桂、炮姜温里散寒，破阴扶阳以温里；又用麻黄辛温发散，开达腠理，宣散寒邪以疏表；再用白芥子散寒祛湿，利气通滞，以通达表里，是临床上攻补兼备、刚柔相济之治痹良方，临床研究证明阳和汤治疗 KOA 疗效良好［3-5］。

表 4 4 组关节液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比较

表 4 4 组关节液中 IL-1β、TNF-α、MMP-13 含量比较

注：与空白组比较，1） P＜0.05；与模型组比较，2） P＜0.05。

组别空白组模型组西乐葆组阳和汤组n 6 6 6 6 IL-1β 11.614±7.004 45.523±31.4891）16.439±10.9371）2）12.932±3.0041）2）TNF-α 164.865±66.339 300.382±27.9931）171.315±39.6661）2）176.641±7.7691）2）MMP-13 125.867±28.266 393.252±110.9891）206.359±65.7881）2）198.437±37.6881）2）

关节软骨的损伤退变及炎症反应是骨关节炎进展的重要因素，许多研究表明Wnt信号通路可能与OA进展和严重程度相关。Wnt是脊椎动物中的分泌型糖蛋白［19］，可以激活不同的级联信号，其中β-catenin是Wnt信号通路的经典途径，该途径的失调被认为是癌症、慢性炎症和退行性疾病发病机理的核心［2］。Wnt蛋白可以与Wnt受体复合物结合，该受体复合物由卷曲受体（FZD）和共激活因子脂蛋白相关蛋白受体5或6（LRP5／6）组成。在Wnt与其受体相互作用后，将带有β-catenin的多蛋白复合物束缚向细胞膜，从而保护β-catenin免于降解，随后β-catenin在细胞中积累并易位至细胞核，与转录因子 ／淋巴增强结合因子（TCF／Lef）结合，激活 βcatenin 的转录活性［20］。 过表达的 Wnt／β-catenin 一方面通过抑制软骨细胞的增殖及Ⅱ型胶原蛋白的分泌导致软骨退化，一方面导致滑膜成纤维细胞过度增殖和Ⅰ型胶原沉积引起滑膜炎症的发生发展［21］。本实验结果显示，模型组软骨组织中Wnt4和β-catenin高表达，经过治疗后二者表达量明显下降、炎症反应及软骨退变程度明显改善，提示阳和汤对兔KOA的防治作用可能与Wnt／β-catenin通路被抑制有关。

研究表明，OA关节组织和滑液中均存在促炎细胞因子，如白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等［22］。 IL-1β 是参与软骨破坏的主要促炎细胞因子，在原代培养的关节软骨细胞中诱导Wnt-5a和Wnt-7a的表达，Wnt表达也刺激了软骨细胞中 β-catenin 的水平升高［23］；而 TNF-α 能诱导滑膜组织中β-catenin、MMP-7等因子的分泌，从而促进滑膜炎症的进一步发展［24］。由此说明IL-1β和TNF-α可能通过Wnt／β-catenin通路驱动OA炎症反应和诱导软骨退变。基质金属蛋白酶（MMPs）在软骨退化中起着重要的作用，在OA患者的关节软骨细胞中发现MMP-1、MMP-9和MMP-13的mRNA高表达，其中MMP-13与OA密切相关，其表达量随着骨性关节炎的进展而逐渐增加，且MMP-13是 Wnt／β-catenin 信号通路的下游因子［25］，受该通路的调控。IL-1β和TNF-α对软骨中MMPs的表达还有直接的诱导作用，既能刺激MMPs在软骨降解中发挥作用，还能阻断新细胞外基质成分的合成［26］。

本实验中各组皮温、膝关节周径、Lequesne MG评分结果显示，阳和汤组兔子膝关节显示出较轻的炎症表现；软骨组织光镜观察及Mankin's评分显示阳和汤对OA软骨组织具有保护作用。课题组前期研究和本次实验室指标检测结果表明阳和汤防治OA的作用部分可能是通过降低炎症因子TNF-α和 IL-1β 的表达，抑制 Wnt／β-catenin信号通路，改善MMP-13对软骨退变的影响来实现的，但其具体机制有待于更深入的实验研究。