健骨颗粒对钛颗粒诱导的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK mRNA的调控作用

林丽琼，林 煜，肖莉莉，冯尔宥，王武炼，张怡元

（厦门大学附属福州第二医院，福建 福州 350007）

人工关节置换术是治疗终末期关节疾病成功有效的方法，假体周围骨溶解是引起人工关节假体无菌性松动、关节置换术中晚期失败的最主要原因［1］。假体磨损表面释放颗粒诱发炎性反应，促进破骨细胞活化成熟，引起假体周围骨溶解吸收［2］。目前无法完全避免假体材料产生磨损颗粒，缺乏有效的预防手段，因此寻找防治假体周围骨溶解的药物是降低假体松动发生率的研究难点及热点。OPG／RANKL／RANK系统是参与骨溶解的核心信号通路［3］，成骨细胞表面分泌核因子-κB受体活化因子配体（receptor activator of NF-кB ligand，RANKL）可与破骨细胞或破骨前体细胞表面的核因子-κB受体活化因子（receptor activator of NF-кB，RANK）结合，促进破骨细胞的分化成熟，并抑制其凋亡；成骨细胞分泌骨保护素（osteoprotegerin，OPG）可竞争性结合RANKL，阻止RANKL与RANK的结合，从而阻断骨溶解信号通路，起骨保护作用。前期研究表明，健骨颗粒含药血清可抑制体外成骨样细胞RANKL mRNA表达，促进OPG mRNA表达，竞争性结合RANKL，抑制骨吸收信号的传递，抑制破骨细胞的生成、活性，从而抑制骨吸收［4-5］。本实验通过研究健骨颗粒对钛颗粒诱导的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系统相关因子的影响，以期为其防治人工关节无菌性松动提供实验基础。

1 实验材料

1.1 实验动物 清洁级3月龄雄性SD大鼠40只，体质量（290±20）g，由福建医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（闽）2012-0001，饲养于福建省中医药研究院比较医学中心，合格证号：医动学第23-016号，实验动物自由饮水进食。

1.2 实验药物 健骨颗粒由煅狗骨、淫羊藿、党参、山茱萸、淮山药等药物组成，原药材购自福建省药材公司，由福建省中医药研究院试车间加工制备，每克健骨颗粒含生药2.9 g。

1.3 实验试剂 钛颗粒（瑞士普鲁斯外科植入物有限公司）；水合氯醛、多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司）；HE染液（北京索莱宝科技有限公司）；TRIzol（美国 invitrogen 公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本 Takara 公司）；SYBRTMPremix Ex TaqTM（日本Takara公司）。

1.4 实验仪器 TS-12U生物组织脱水机、BM-VⅡ石蜡包埋机（孝感亚光医用电子技术有限公司）；RM2235石蜡切片机、DM4000B正置显微镜（德国Leica公司）；Infinite M200酶标仪（瑞士Tecan公司）；2 000超微量分光光度计（美国 Nanodrop公司）；S1000PCR扩增仪（美国BIO-RAD公司）；7 500 Fast荧光定量PCR仪（美国ABI公司）。

2 实验方法

2.1 钛颗粒混悬液制备 磨损颗粒采用钛颗粒，平均直径小于10 μm。将钛颗粒置于180℃烤箱6 h，70%乙醇浸泡48 h，PBS洗涤，梯度离心，无水乙醇浸泡24 h，沉淀钛颗粒，去除无水乙醇后自然干燥，精密天平分装成30 mg／包，高压蒸汽灭菌30 min，60℃恒温箱烘干后，4℃保存备用。钛颗粒通过内毒素检测试剂盒检测钛微粒内毒素＜0.25 Eu／mL。临用前加入生理盐水配置成10 mg／mL的钛颗粒混悬液。

2.2 动物分组及模型制备 大鼠适应性喂养1周，完全随机法选取10只取其颅骨作为植骨的供体，随机选取30只分为对照组、模型组、健骨颗粒组各10只。大鼠脱颈椎处死，沿颅正中线剪开皮肤，分离颅骨，将颅骨修成4 mm×3 mm大小，完整保留颅骨表面骨膜，置于无菌生理盐水中备用。

参照文献［6］制备植骨气囊骨溶解模型，以大鼠背部正中线距尾根部10 cm为中心，电动剃毛刀剃毛，背部备皮消毒，每天皮下注射无菌空气，每次1 mL，连续5天，形成气囊，建立气囊模型；大鼠禁食不禁水，称重，10%水合氯醛按0.3 mL／100 g剂量腹腔注射麻醉，碘伏消毒，铺无菌单，沿气囊边缘作切口，将颅骨片植入气囊中心，每只大鼠植入1片颅骨片，缝合切口，建立气囊植骨模型。对照组大鼠气囊内注射0.5 mL生理盐水，模型组、健骨颗粒组气囊内注射0.5 mL钛颗粒悬液，建立骨溶解病理模型。

2.3 药物干预 术后24 h进行药物干预，大鼠灌胃剂量按实验动物体表面积换算，健骨颗粒组按2 g／（kg·d）予健骨颗粒混悬液灌胃，对照组和模型组予等量生理盐水灌胃，连续灌胃2周。实验大鼠均在相同条件下自由摄食、饮水。灌胃结束后取材，取出完整气囊，将样本一切为二，一份置于4%多聚甲醛中固定备用；一份过液氮置于－80℃超低温冰箱保存备用。

2.4 观察指标及方法

2.4.1 HE染色 将样本置于4%多聚甲醛中室温下固定24 h后，10%乙二胺四乙酸二钠脱钙4周；水洗，经梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋；以颅骨矢状面为切面，6 μm厚度连续切片，切片脱蜡至水，Ehrlich苏木素染色40 min，水洗返蓝，伊红染色1 min，脱水透明，中性树胶封片，光镜下观察囊壁炎症反应及植骨边缘溶解情况。200倍镜下随机选取4个视野，采用Image Pro Plus 6.0图像分析软件计算阳性细胞数量，取均值作为细胞密度。2.4.2 IL-1β、TNF-α含量检测 取出液氮中样本，研磨成粉，加入PBS混匀，3000 r／min离心10 min，取上清液，严格按照ELISA试剂盒说明书操作，酶标仪测定吸光度，绘制标准曲线，计算样本IL-1β、TNF-α含量。

2.4.3 OPG、RANKL mRNA表达检测 采用Realtime PCR法检测，预冷研体，-80℃中取出样本，加液氮研磨为粉状，采用TRIzol提取总RNA，超微量分光光度计测A260／A280比值，按逆转录试剂盒逆转录合成cDNA，-20℃保存备用。采用ABI 7500 Fast进行荧光实时定量PCR，引物由Takara公司合成，β-actin：上游 5′AGGCTGTGTTGTCCCTGTA 3′，下游 5′ATGTCACGCACGATTTCC 3′，产物长度 193 bp；OPG：上游 5′CGAAAGCACCCTGTAGGAA 3′，下游5′TGTCCACCAGAACACTCAGC 3′，产物长度 145 bp；RANKL：上游5′TGGAGAGCGAAGACACAGA3′，下游 5′CAGACTGACTTTATGGGAACC 3′，产物长度250 bp。 反应体系：（2×）SYBR Premix Ex Taq 10 μL，（50×）ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL，（10 μM）PCR Forward Primer 0.4 μL， （10 μM）PCR Reverse Primer 0.4 μL，cDNA 模板 2 μL，灭菌水 6.8 μL。 反应条件：95 ℃，30 s预变性；95 ℃ 5 s，58 ℃ 10 s，72℃ 15 s，共 40个循环。β-actin为内参基因，测定目标基因Ct值，以对照组相对表达量为1，2-ΔΔCt计算目的基因相对表达量。

2.5 统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用单因素方差分析；非正态分布采用非参数检验。

3 结 果

3.1 HE染色 HE染色显示对照组（图1A）植入颅骨片较完整，骨片表面未见明显骨吸收，囊壁组织与骨片贴合欠佳，囊壁组织炎性反应轻，以成纤维细胞为主，可见少量的炎症细胞；模型组（图1B）骨片表面可见明显骨吸收，植骨溶解凹陷，囊壁组织与骨片贴合较紧，囊壁增厚，可见明显炎症细胞浸润；健骨颗粒组（图1C）骨片表面可见骨吸收陷窝，植骨溶解程度、囊壁厚度、炎症细胞浸润较模型组低。

3.2 3组干预后IL-1β、TNF-α含量比较 见表1。

3.3 3组干预后 OPG、RANKL mRNA表达比较见表2。

4 讨 论

人工关节置换术后假体磨损颗粒诱发炎性反应，单核巨噬细胞增多。单核巨噬细胞可作为破骨细胞前体分化为破骨细胞，炎症细胞浸润释放多种炎症因子， 如 IL-1β、IL-6、TNF-α、M-CSF、PGE2等［7-8］，是强大的骨吸收诱导剂，可增加破骨细胞的活性。破骨细胞是体内唯一具有骨吸收、骨溶解作用的细胞，其数量的增加和活性的增强引起假体周围骨溶解，使假体与骨之间空隙增大，造成假体松动。

图1 植骨囊壁的HE染色图（×50）

表2 3 组干预后 IL-1β、TNF-α 含量比较（x±s）pg／mL

表3 3组干预后OPG、RANKL mRNA表达比较（x±s）

健骨颗粒以“肾主骨，生髓”“补先后天”理论为指导，选取煅狗骨、淫羊藿、山茱萸、党参、淮山药等组方而成，旨在补肾健脾、强筋壮骨。药理研究表明：煅狗骨可促进骨基质、新骨形成［9］；淫羊藿苷可抑制RAW264.7向破骨细胞分化及骨吸收活性［10］，淫羊藿苷、淫羊藿黄酮类促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞增殖分化［11-12］；山茱萸总苷可增加骨小梁活性成骨细胞表达，促进骨髓基质干细胞增殖，提高去势大鼠骨小梁面积［13-14］；党参炔苷可促进雌性大鼠卵巢颗粒细胞增殖分泌雌二醇［15］。OPG／RANKL／RANK系统是参与骨溶解的核心信号通路，假体旁界膜中存在一个完整的OPG／RANKL／RANK系统，磨损颗粒促使OPG／RANKL比值失衡，从而使假体周围骨动态失衡，骨吸收活性增强。

本研究中，通过钛颗粒诱导大鼠建立骨溶解模型，采用载体实验探讨健骨颗粒对钛颗粒诱导的骨溶解模型大鼠OPG／RANKL／RANK系统相关因子的影响，研究结果显示：钛颗粒可刺激植骨气囊周围组织的炎症细胞浸润、新生血管增生和渗出，炎性反应明显，引起破骨细胞分化成熟，植入颅骨片边缘骨溶解显著，与临床人工关节无菌性松动相似，是关节置换术中晚期失败的主要原因。健骨颗粒可降低血清炎症因子表达水平，减少植骨气囊的炎症细胞浸润，一定程度上减轻炎性反应程度，并调控OPG／RANKL比值，抑制破骨细胞活性，减少颅骨片边缘骨吸收陷窝，提示健骨颗粒对于假体周围骨溶解有潜在防治作用。

综上所述，健骨颗粒可有效降低炎症反应程度，调控OPG／RANKL比值，抑制破骨细胞活性，可能是其防治人工假体松动的作用机制之一，为其临床用药提供实验基础。

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