解郁合欢汤、血府逐瘀汤、天王补心丹抗抑郁作用初步筛选研究

贾铷，方宇骅，陈喆鸣，陈燕，张淑玲，王玉露

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

解郁合欢汤、血府逐瘀汤、天王补心丹抗抑郁作用初步筛选研究

贾铷，方宇骅，陈喆鸣，陈燕，张淑玲，王玉露

（福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的从解郁合欢汤、血府逐瘀汤和天王补心丹3种复方水煎剂中初步筛选出有潜在抗抑郁效果的复方。方法取健康SPF级雄性KM小鼠50只，根据旷场试验结果随机分成空白组、盐酸氟西汀组、解郁合欢汤组、血府逐瘀汤组和天王补心丹组5组，每日灌胃给药1次，连续给药14 d。每周进行悬尾试验、强迫游泳试验观测小鼠行为学变化；给药结束后测定小鼠自发活动；行为学试验结束后，用Western Blot法测定小鼠海马p-GSK3β的表达量。结果①与空白组相比，血府逐瘀汤组和天王补心丹组在给药第1周和第2周均能显著缩短小鼠悬尾和游泳不动时间，作用与盐酸氟西汀组相当，其中天王补心丹组作用最显著；解郁合欢汤组有作用趋势，但无显著性差异。②3种复方均不影响小鼠自发活动。③3种复方均能增加小鼠海马p-GSK3β的表达量，天王补心丹组作用最显著。结论天王补心丹抗抑郁效果较强，其作用机制可能与增加海马p-GSK3β的表达有关。

抗抑郁；行为学；解郁合欢汤；血府逐瘀汤；天王补心丹；Western Blot

抑郁症（major depressive disorder，MDD）是当今社会上一种常见的精神疾病，它对患者的行为、思想及精神状态产生负面、消极的影响［1］。临床常用的抗抑郁西药虽然药效显著，但有明显毒副作用，可诱发躁狂、烦躁不安、情绪激动、失眠和行为混乱等问题［2-3］。考虑到抑郁症治疗需要长期用药，所以探寻毒副作用更小的抗抑郁药十分重要，传统中药或许能对抑郁症治疗提供帮助。

相对于现代抗抑郁药物，传统中药抗抑郁药物的发展更为缓慢，也更加注重临床效果。具有抗抑郁效果（或类抗抑郁效果）的中药复方，按照抑郁症对应症状分类，主要可分为3类，即疏肝解郁类、养心安神类和活血化瘀类。解郁合欢汤出自清代费伯雄的《医醇剩义》［4］，具有疏肝清火解郁、养血安神功效；血府逐瘀汤出自清代王清任的《医林改错》［5］，具有活血祛瘀、行气止痛功效；天王补心丹出自《世医得效方》［6］，具有滋阴养血、补心安神功效。

现代医学所定义的抑郁症与中医郁症相似［7］。解郁合欢汤［8］、血府逐瘀汤［9］、天王补心丹［10］的主治症皆与抑郁症的病征相似，结合临床案例我们推测这3种复方均具有抗抑郁作用。本研究通过探究3种复方对抑郁模型小鼠的行为学和海马p-GSK3β表达的影响，以期筛选出抗抑郁效果较显著的复方。

1 材料与药品

1.1 动物及分组SPF 级KM小鼠，雄性，体质量18～22 g，吴氏实验动物中心提供，许可证号：SCXK（沪）2012-0002。小鼠根据体质量随机分为5组，每组10只，室内适应性饲养7 d后开始正式实验，自由饮水进食。盐酸氟西汀组每天给予盐酸氟西汀（10 mg／kg）灌胃，解郁合欢汤组按照《医醇剩义·卷二》组方，血府逐瘀汤组和天王补心丹组均按《方剂学》［11］所记载剂量换算成小鼠用量，空白组给予蒸馏水灌胃。每只小鼠给药量：解郁合欢汤、血府逐瘀汤和天王补心丹分别为6.8 g／kg、7.8 g／kg和13.2 g／kg，每日灌胃1次，连续给药14 d。

1.2 药品解郁合欢汤组成：合欢花6 g，郁金6 g，沉香1.5 g，当归6 g，白芍3 g，丹参6 g，柏子仁6 g，山栀4.5 g，柴胡3 g，薄荷3 g，茯神6 g，红枣5枚，橘饼12 g。血府逐瘀汤组成：当归9 g，生地黄9 g，桃仁12 g，红花9 g，枳壳6 g，赤芍6 g，柴胡3 g，甘草6 g，桔梗4.5 g，川芎4.5 g，牛膝9 g。天王补心丹水煎剂组成：丹参9 g，当归10 g，人参10 g，茯苓12 g，五味子8 g，麦冬10 g，天冬9 g，生地黄15 g，玄参10 g，远志9 g，酸枣仁12 g，柏子仁10 g，桔梗8 g。以上药材均购自福州回春药店和福州瑞来春堂，经杨成梓教授鉴定均属《中国药典》收载药材。复方水煎剂制备方法：上述药材适量3倍水浸泡30 min，文火煎煮1 h，过滤，滤液备用；滤渣加入3倍量水煎煮1 h，过滤，合并滤液，浓缩至预设的浓度，药液于4℃冰箱保存备用。盐酸氟西汀胶囊（百忧解，礼来苏州制药有限公司，批号：1017A），使用蒸馏水配成相应浓度药液（10 mg／kg）。

1.3 实验材料悬尾实验装置（自制）；强迫游泳实验装置（自制）；小鼠旷场箱（自制）。

2 方法

2.1 分组小鼠根据初次旷场实验结果随机分为5组：空白组、盐酸氟西汀组、解郁合欢汤组、血府逐瘀汤组、天王补心丹组，每组10只。

2.2 小鼠悬尾试验参考文献［12］，将小鼠尾部距尖端约2 cm（1／3）处用胶带粘贴于横杆上，前肢距离台面约5 cm。录像记录6 min内小鼠的挣扎状况，记录后4 min内小鼠不动状态持续的时长。小鼠转体、扭曲等挣扎行为皆属于活动状态；小鼠前肢小幅摆动而躯干及后肢不动视为静止状态。该实验在实验第6天和第13天给药1 h后进行。该实验前不禁食、不禁水。

2.3 小鼠强迫游泳试验参考文献［12］，将小鼠置于盛有水的大烧杯中，大烧杯水深18 cm，水浴加热至并保持水温为（25±1）℃。对6 min内的小鼠游泳录像，对后4 min内小鼠活动情况进行分析，记录后4 min内小鼠不动状态持续的时长。小鼠游泳等挣扎行为皆属于活动状态；小鼠前肢小幅摆动而整体未在水中游动视为静止状态。该实验在实验第7天和第14天给药1 h后进行。该实验前不禁食、不禁水。

2.4 小鼠自发活动测定参考文献［13］，在行为学测试结束后，在第14天将小鼠放置于小鼠旷场箱内，对5 min内小鼠的自发活动状况进行观察。实验装置为50 cm×50 cm×40 cm木箱，周壁黑色，底部等分为25方格，分别记录小鼠水平得分（三爪以上跨入邻格的次数）和垂直得分（两前肢离地1 cm以上的次数）。

2.5 Western Blot法检测小鼠海马p-GSK3β的表达动物实验结束后断头，在低温环境下迅速取出小鼠双侧海马并提取总蛋白，用BCA法测定其蛋白含量。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离出目标蛋白后，转印至硝酸纤维素膜（NC膜）上；将NC膜浸于含5%脱脂奶粉的Tris缓冲液（Tris buffered saline，TBS）中室温封闭2 h，用含0.05%吐温20的TBS缓冲液（TBST）漂洗3次，一抗（p-GSK3β 1∶1 000，β-actin 1∶1 000）4℃孵育过夜；TBST漂洗3次，二抗（1∶3 000）室温孵育1 h，漂洗干净，凝胶成像仪显影。采用p-GSK3β与β-actin的吸光度比值表示蛋白的相对表达量。

2.6 统计学方法采用统计软件GraphPad Prism 5.0进行数据分析。计量资料属正态分布以（Means±SEM）表示，采用单因素方差分析（oneway ANOVA）的Dunnett’s检验。

3 结果

3.13 种复方对小鼠悬尾不动时间影响见图1。

图1 3种复方给药2周内对小鼠悬尾不动时间影响

3.23 种复方对小鼠强迫游泳不动时间影响见图2。

图2 3种复方给药2周内对小鼠游泳不动时间影响

3.33 种复方对小鼠自发活动影响见表1。

表1 3种复方对小鼠自发活动影响（Means±SEM）次

3.43 种复方对小鼠海马区p-GSK3β表达影响见图3。

图3 3种复方给药2周后对小鼠海马区p-GSK3β表达影响

4 讨论

天王补心丹在悬尾试验和强迫游泳试验中均表现出改善抑郁绝望状态的效果，并能显著增加小鼠海马p-GSK3β的表达，说明天王补心丹有很好的抗抑郁作用，其作用机制可能与影响海马p-GSK3β的表达有关。

本实验目的在于对3种可能有抗抑郁效果的中药复方进行初筛，因此没有采用慢性应激模型，而是直接采用对正常小鼠给药并对其进行行为学方法测定来初步断定药物是否有抗抑郁效果。悬尾试验是Stem等［14］介绍的一种较为简单的评价抗抑郁药物效果的实验方法。在某些实验中，小鼠在不可逃避的应激条件下，表现出的不动状态反映了放弃求生动作的绝望行为，这种绝望行为可模拟出人类的抑郁状态。根据此原理，研究者采用小鼠悬尾试验，从而复制出小鼠的绝望行为模型，用以评价抗抑郁药物的作用。悬尾试验能直接反映小鼠的体能状态和激惹和绝望程度，也可间接反映小鼠的情志如肝气肝火盛衰、气虚程度。强迫游泳试验是Porsolt等人［15］介绍的一种比较直观评价抗抑郁药物的试验方法。强迫游泳试验能通过小鼠静止时间直观地反映小鼠的体能和绝望程度，也是一种评价小鼠虚证乏力状态的理想试验方法。本研究测试中发现：3种复方均有一定程度的抗抑郁效应，并且从第1周就开始有效，其中血府逐瘀汤和天王补心汤作用优于解郁合欢汤，而天王补心丹在悬尾试验中表现出了显著的抗抑郁作用优势，可筛选为进一步研究的抗抑郁药物。为了避免假阳性结果，我们还进行了小鼠旷场试验以验证药物对小鼠的自发活动没有影响，说明其不动时间的缩短并非药物的中枢兴奋作用引起的。

脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）被视为神经可塑性的标志［16］，可促进神经元的成长和分化，并参与调控神经元形成神经网络的整个过程，是抑郁症发病和治疗的关键因素。随着对抑郁症发病机制的深入研究，新近在BDNF相关信号通路研究中，糖原合酶激酶3β（glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）的作用越来越受到瞩目。研究发现抑郁症死亡患者大脑前额皮层的GSK3β活性升高，并伴随Akt活性的降低［17］；临床上能够升高大脑5-HT水平的抗抑郁药例如单胺氧化酶抑制剂、氟西汀、丙咪嗪还有5-HT本身能够增强GSK3β的磷酸化；基因阻断小鼠抑制GSK3β磷酸化过程可抵消抗抑郁药氟西汀的促神经元再生作用［18］；杂合子GSK3β敲除小鼠在强迫游泳试验和悬尾试验中表现出抗抑郁样行为［19］；选择性GSK3β抑制剂能在抑郁症动物模型上产生抗抑郁作用并促进神经元再生［20－21］。这些都预示着这一机制在抗抑郁药物治疗过程中可能起着相关作用，GSK3β有可能成为抗抑郁治疗的重要潜在的靶标。因而近年来围绕与GSK3β相关的抑郁细胞信号通路也越来越受到研究者的关注，主要有两种信号通路：Wnt／GSK3β／β-catenin信号通路和PI3K／AKt／GSK3β信号通路，其中p-GSK3β可抑制GSK3β的活性，使BDNF表达增强。

本实验拟在行为学筛选的基础上探索药物的抗抑郁机制，研究发现3种复方对小鼠海马p-GSK3β表达均有增强，以天王补心丹作用最为显著。因此我们得出结论：天王补心丹有较好的抗抑郁效应，其抗抑郁机制可能与GSK3β信号通路有关。

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0031-03

2017－03－10

福建省教育厅中青年教育科研项目课题（JAT160235）；福建中医药大学校管课题（X2015026）

贾铷（1978—），女，实验师，主要从事中药神经精神药理学研究。

王玉露（1975—），女，医学博士，副教授。E-mail：luoyang5466@163.com