愈肺宁方干预COPD外周血单个核细胞分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的作用

洪春霖，洪敏俐，陈慧暖，柯庚申，李风森

（1.福建中医药大学附属漳洲中医院，福建漳州363000；2.新疆维吾尔自治区中医医院国家中医临床研究基地，新疆乌鲁木齐830000）

愈肺宁方干预COPD外周血单个核细胞分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的作用

洪春霖1，洪敏俐1，陈慧暖1，柯庚申1，李风森2

（1.福建中医药大学附属漳洲中医院，福建漳州363000；2.新疆维吾尔自治区中医医院国家中医临床研究基地，新疆乌鲁木齐830000）

目的探讨愈肺宁方对慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者外周血单个核细胞（PBMCs）分泌白介素-17A（IL-17A）、转移生长因子β1（TGF-β1）和IL-6的影响。方法收集2012年12月—2014年6月在福建中医药大学附属漳州中医院就诊的COPD稳定期患者（COPD组）55例和健康志愿者（健康对照组）30例，采集静脉血，分离PBMCs，分别加入植物凝集素（PHA）以及PHA和不同剂量愈肺宁浸出液（2 mg／mL和5 mg／mL），培养48 h后，用酶联免疫吸附（ELISA）法检测上清液中IL-17A、TGF-β1和IL-6的浓度。结果COPD组PBMCs经PHA活化后，其分泌的IL-17A、TGF-β1和IL-6均明显增加（P均＜0.01），并高于健康对照组（P均＜0.01）；加入愈肺宁干预后，IL-17A浓度明显降低（P均＜0.01），且呈剂量依赖负相关（r＝-0.30，P＜0.01）；高剂量愈肺宁使TGF-β1浓度降低（P＜0.01），而低剂量愈肺宁对TGF-β1浓度无影响，高低剂量愈肺宁对IL-6浓度均无影响。结论干预IL-17A和TGF-β1分泌可能是愈肺宁治疗稳定期COPD的机制之一。

慢性阻塞性肺疾病；愈肺宁方；PBMCs；IL-17A；TGF-β1；IL-6

慢性阻塞性肺疾病（COPD）的病理机制涉及多种炎症因子，包括白介素-8（IL-8）、白介素-6（IL-6）、转移生长因子β1（TGF-β1）和白介素-17A（IL-17A）等细胞因子，与COPD的气道炎症和结构重塑密切相关［1］。愈肺宁方是全国名老中医戴舜珍主任的经验方，具有补肺健脾、益气固表、补肾纳气、宣肺化痰、活血化瘀等功效。我们前期的临床研究证实：愈肺宁可以改善COPD患者CAT评分、呼吸困难评分（mMRC）和6 min步行距离（6MWD），减轻临床症状，降低血清IL-8、肿瘤坏死因子α（TNF-α）和C反应蛋白（CRP）等炎性因子水平［2-3］。本研究采用体外干预，观察愈肺宁对COPD患者外周血单个核细胞（PBMCs）分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6等细胞因子的影响，以进一步阐明愈肺宁治疗COPD的作用机制，现报告如下。

1 临床资料

1.1 诊断标准COPD诊断标准依据中华医学会呼吸病学分会慢性阻塞性肺疾病学组制定的《慢性阻塞性肺疾病诊治指南（2007年修订版）》［4］；中医辨证根据《慢性阻塞性肺疾病中医诊疗指南（2011版）》［5］和课题组前期研究［2］拟定，肺脾肾虚损、痰瘀互结的辨证标准：①久咳、痰白；②胸闷或闷痛；③喘促短气，动则尤甚，呼多吸少；④神疲乏力；⑤易患感冒；⑥纳差，便溏；⑦头晕耳鸣，腰膝酸软；⑧小便频数，夜尿多；⑨面目或下肢浮肿；⑩唇暗或面色晦暗；11○舌下脉络曲张，舌质淡暗或暗红或有瘀斑，脉细弱或沉细。具备①～③项中2项，④～⑨中2项，⑩～11○中1项即可诊断。

1.2 纳入标准①男女不限，年龄40～80岁；②符合COPD诊断标准，临床分期属稳定期；③中医辨证属肺脾肾虚损，痰瘀互结。

1.3 排除标准①最近两周有发生上呼吸道感染；②最近1个月有全身使用糖皮质激素者；③精神病患者；④合并有肝、肾、心血管和造血系统等严重疾病者；⑤不愿接受研究措施或者有其他原因不能合作者。

1.4 健康对照组纳入标准①体格检查正常，年龄40～80岁；②无吸烟史；③无急、慢性呼吸道疾病；④胸部X线检查无明显异常；⑤最近1个月未使用抗生素以及全身使用糖皮质激素治疗；⑥无明显心血管疾病；⑦无糖尿病和自身免疫性疾病。

1.5 一般资料研究对象来自2012年12月—2014年6月在福建中医药大学附属漳州中医院就诊的COPD稳定期患者（COPD组）55例和健康体检的志愿者（健康对照组）30例。2组性别、年龄比较无统计学意义（P＞0.05）。COPD组的第1秒钟用力呼气容积（FEV1）、1秒钟用力呼气容积占预计值百分比（FEV1／%pre）及FEV1／用力肺活量（FEV1／FVC，1秒率）均明显低于健康对照组。本研究经福建中医药大学附属漳州中医院医学伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。见表1。

表1 2组一般情况比较（x±s）

2 方法

2.1 药物配制愈肺宁主要成分：党参、黄芪、防风、白术、菟丝子、核桃肉、瓜蒌、杏仁、浙贝母、丹参、桃仁等组成，免煎颗粒，由培力（南宁）药业有限公司生产提供。参考Chen等［6］的方法及预实验，用磷酸盐缓冲液溶解愈肺宁免煎颗粒，并调整药液浓度为1 g／mL（相当于生药质量）。

2.2 试剂和仪器淋巴细胞分离液（Ficoll，美国GE医疗集团）；pH7.0磷酸盐缓冲液（PBS，美国GE医疗集团）；RPMI-1640细胞培养基（美国GE医疗集团）；胎牛血清（FBS，美国GE医疗集团）；1%青酶素／链酶素（美国GE医疗集团）；植物凝集素（PHA，美国Thermo Fisher公司）；IL-17A、TGF-β1和IL-6 ELISA试剂盒（美国eBioscience公司）；二氧化碳培养箱、低温离心机（美国Thermo Fisher公司）；生物安全柜（力康生物医疗科技控股有限公司）；酶标仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）。

2.3 PBMCs的分离采集COPD稳定期患者和健康志愿者的外周血20 mL经肝素抗凝，参照前期研究［7］的方法，用Ficoll分离获取PBMCs，经PBS洗涤1次，用含10%FBS的RPMI-1 640细胞培养液重悬细胞，调整细胞终浓度为1×106／L。

2.4 PBMCs分组培养①空白亚组，PBMCs在含10%FBS的RPMI-1640中培养；②PHA亚组：在含PBMCs培养液中加PHA，终浓度为10 μg／mL；③PY2亚组和PY5亚组：PHA加愈肺宁，在PHA组基础上加愈肺宁，使愈肺宁终浓度分别为2 mg／mL（PY2亚组）和5 mg／mL（PY5亚组）。各亚组细胞培养液置于48孔细胞培养板，在37℃含5%CO2的恒温饱和湿度的孵育箱内培养48 h，收获细胞培养液，分离上清液，置－80℃冻存备用，用台盼兰检查培养后细胞存活情况。

2.5 培养物上清液细胞因子测定IL-17A、TGF-β1和IL-6浓度测定按照eBioscience试剂盒说明书完成。

2.6 统计学方法统计软件采用SPSS20.0。计量资料符合正态分布以（x±s）表示，采用t检验，相关性分析采用Peason相关分析；计数资料采用χ2检验。

3 结果

3.1 愈肺宁对2组PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的影响见表2。

表2愈肺宁对2组PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6的影响（x±s）

3.2 愈肺宁剂量与IL-17A浓度的相关性分析见图1。

3.32 组培养后PBMCs存活率比较见表3。

表3 2组培养后PBMCs存活率比较（x±s）%

图1 愈肺宁剂量与IL-17A浓度的相关性分析

4 讨论

PHA是一种丝裂原，能够非特异性地刺激T淋巴细胞活化，分泌多种细胞因子，包括IL-17A、TGF-β1和IL-6［7－8］等。本研究结果显示：经PHA刺激，COPD组和健康对照组PBMCs分泌IL-17A、TGF-β1和IL-6均明显增加，COPD组明显高于健康对照组，提示COPD患者分泌3种细胞因子的细胞增多或者分泌功能亢进。

IL-17A与COPD气道炎性反应和结构重塑密切相关。IL-17A刺激气道上皮细胞分泌多种细胞因子，包括IL-8、IL-6和粒细胞集落刺激因子（GCSF）等，这些细胞因子募集中性粒细胞进入炎症组织［9］；IL-17A还通过刺激气道上皮细胞分泌黏液和基质金属蛋白酶9（MMP-9），MMP-9分解胶原蛋白和弹性蛋白，使肺泡表面和肺组织中弹性蛋白丧失，破坏肺泡壁引起肺结构重塑［10］。COPD患者的气管和肺实质IL-17A表达明显增高，而且与FEV1%pre、一氧化碳弥散量占预计值的百分比（DLCO%预计值）和身体质量指数（BMI）呈负相关，与CAT评分呈正相关［11］。本研究结果显示：愈肺宁干预使COPD患者PBMCs分泌IL-17A减少，且呈剂量依赖负相关。中医药治疗COPD稳定期可能通过调控细胞因子的表达从而减轻炎性反应和气道结构的破坏，改善临床症状。刘颖等［12］研究证实固本止咳中药可以明显降低COPD模型鼠的肺组织中γδT淋巴细胞比例，并同步降低肺组织淋巴细胞培养物的IL-17A浓度。本课题组［7］前期研究也表明：中药制剂喘可治注射液可以明显抑制COPD患者PBMCs分泌IL-17A，且与喘可治呈剂量负相关。

本研究结果显示：低剂量愈肺宁干预COPD患者PBMCs分泌TGF-β1无明显变化，高剂量愈肺宁使TGF-β1分泌减少。TGF-β1是一种多功能生长因子，主要通过趋化气道炎性细胞、促进纤维细胞增殖与分化、气道平滑肌细胞增生和细胞外基质合成与沉淀等机制参与气道结构重塑。COPD患者小气道上皮细胞表达TGF-β1增加，TGF-β1 mRNA水平与COPD患者小气道V25%、V50%值呈负相关，体外培养的上皮细胞自释放TGF-β1免疫活性升高［13］。干预TGF-β1表达可能是中药治疗COPD的另一个机制，冯翠灵等［14］研究显示：中药芪蛭益肺颗粒能够降低COPD模型鼠的小气道上皮细胞、肺组织的TGF-β1表达。

IL-6是一种炎症细胞因子、急性时相蛋白，在全身性系统性炎症时，血清IL-6明显升高，是COPD的炎症指标之一。COPD稳定期患者的血清IL-6水平明显升高，这增加了COPD患者抑郁的危险和死亡率［15］。本研究结果显示：高低剂量愈肺宁对IL-6浓度均无影响，提示愈肺宁不能干预IL-6分泌。IL-6具有促进Th0细胞向Th17细胞分化，并促使IL-17A分泌增多，IL-17A又诱导靶细胞分泌IL-6。但本研究未显示IL-6浓度伴随IL-17A浓度下降而下降，其机制尚待研究。

培养后细胞存活率结果表明：高低剂量愈肺宁对COPD组和健康对照组的培养细胞存活率均无影响，说明细胞因子浓度降低并非愈肺宁杀死细胞所致。研究结果提示，愈肺宁可以抑制COPD患者PBMCs分泌IL-17A和TGF-β1，这可能是愈肺宁治疗稳定期COPD的机制之一，其调控途径有待进一步研究。

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R285.5

A

1000-338X（2017）04-0034-03

2017-04-08

国家中医药管理局国家中医临床研究基地业务建设科研专项课题（JDZX2012168）；福建省漳州市自然科学基金科技项目（ZZ2012J38）；国家中医药管理局2011年全国名老中医传承工作室建设项目；福建省中医肺系病重点研究室建设项目（内科类-5）

洪春霖（1972—），男，主管技师，主要从事中西医结合呼吸系统疾病的病理机制研究。

洪敏俐（1967—），女，主任医师，教授，硕士研究生导师。E-mail：1501499678@qq.com李风森（1963—），男，主任医师，教授，博士研究生导师。E-mail：fengsen602@163.com