玳玳果降脂提取物急性毒性试验研究

陈红，马国萍，陈丹，黄娇，谢平，朱仙慕

（1.福建省立医院干一科临床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中医药大学药学院，福建福州350122）

玳玳果降脂提取物急性毒性试验研究

陈红1，马国萍2，陈丹2，黄娇2，谢平2，朱仙慕2

（1.福建省立医院干一科临床老年病研究所，福建福州350001；2.福建中医药大学药学院，福建福州350122）

目的观察玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性，初步评价其用药安全性。方法取40只体质量24～29 g昆明种小鼠，随机分成给药组与空白组各20只，雌雄各半，选用最大耐受量（MTD）法试验。给药组按玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大浓度（0.8 018 g／mL）及小鼠可承受的最大体积（0.4 mL／10 g）一次性口服灌胃，空白组蒸馏水（0.4 mL／10 g）灌胃。灌胃给药1次，连续观察14 d，记录小鼠的毒性反应、死亡情况。结果无法得出玳玳果降脂提取物LD50；给药后连续观察14 d，小鼠未见中毒反应，无动物死亡；给药14 d后解剖小鼠，肉眼未见脏器异常；脏器指数评价，2组比较无显著性差异（P＞0.05）。结论小鼠灌胃给药最大耐受剂量为32.07 g／kg，相当于临床成人日用量的285.07倍，提示玳玳果降脂提取物口服毒性小，临床剂量下用药安全。

玳玳果降脂提取物；最大耐受量；急性毒性试验

玳玳（Citrus aurantium L.var daidai Tanaka）属芸香科柑桔亚属，为酸橙变种，药食同源植物，在我国福建闽北、浙江、四川一带广为栽培。玳玳又称代代，其果在民间作为苏枳壳被应用于中医临床，资源丰富且药材相关不良反应少，是一种具有广泛开发应用价值的药用植物［1］。课题组以往研究表明：闽产玳玳果中含有黄酮、生物碱、挥发油等化学成分［2-4］，由其分离制备的玳玳果黄酮提取物具有良好的降脂抗氧化作用［5-8］。本研究根据中药、天然药物急性毒性研究的相关指导原则［9］，以最大给药浓度和小鼠最大灌胃体积给药，考察玳玳果降脂提取物的急性毒性反应，评价其口服用药安全性，为获得质量稳定、安全的玳玳果降脂提取物提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 受试药物玳玳果降脂提取物（总黄酮含量82.7%，批号20170405），实验室自制，取玳玳果药材适量，6倍量75%乙醇回流提取3次，回收乙醇，减压干燥，得玳玳果总黄酮粗提物；经AB-8型大孔吸附树脂纯化，收集50%乙醇洗脱液，回收溶剂，减压干燥，得玳玳果总黄酮提取物。

1.2 动物体质量24～29 g昆明种小鼠60只，雌雄各半，清洁级，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证编号：2015000520265。实验前均在福建中医药大学实验动物中心适应性饲养7 d，使用许可证号：SCXK（沪）2012-0002。

1.3 主要仪器ARA 520百分之一电子天平及AR 2140万分之一电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；100 mL三角烧瓶；50 mL烧杯；2 mL注射器。

1.4 统计学方法采用SPSS 18.0软件进行数据处理，计量资料属正态分布以（x±s）表示，采用t检验。

2 方法与结果

2.1 药液配制取玳玳果降脂提取物24.06 g，临用时用30 mL蒸馏水溶解，配制成具有一定黏稠度的混悬液，黏稠度以灌胃针测试，至抽药吸取较难但不至于无法吸取的程度为止，即得玳玳果降脂提取物的最大浓度药液（0.8 018 g／mL）。

2.2 小鼠急性毒性LD50预实验取昆明种小鼠20只，雌雄各半，体质量24～29 g，给药前禁食不禁水16 h，灌胃给药玳玳果降脂提取物药液1次，按本品可以灌胃的最大浓度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大体积（0.4 mL／10 g）灌胃给药，给药后自由进食和进水，并连续观察7 d，观察小鼠死亡数、体征变化及生理反应，拟找出100%死亡率，即Dm值。实验结果表明：各组小鼠无死亡，状况良好，无明显中毒反应，无数据计算玳玳果降脂提取物LD50，故实验选用玳玳果降脂提取物的最大耐受量（MTD）法试验。

2.3 玳玳果降脂提取物急性毒性MTD法实验取体质量24～29 g昆明小鼠40只，随机分为给药组与空白组各20只，雌雄各半，给药前禁食不禁水16 h，给药组按提取物可以灌胃给药的最大浓度（0.8 018 g／mL）、小鼠可承受的最大体积（0.4 mL／10 g）灌胃给药，空白组蒸馏水灌胃（0.4 mL／10 g）。灌胃给药1次。给药当天密切观察4 h内2组小鼠灌胃后的症状，给药4 h后自由进食进水。连续观察14 d，观察记录小鼠外观、行为、分泌物、排泄物、中毒症状以及死亡情况；同时称量给药前后14 d内的体质量，观察小鼠体质量变化；若有小鼠死亡，立刻将死亡小鼠解剖，肉眼观察小鼠各脏器；待第14天称重后脱颈处死各组小鼠，肉眼观察小鼠主要脏器组织是否有肉眼可见病变，若发现肉眼可见病变，则进行病理组织形态学检查；同时称取2组小鼠的各脏器湿重，计算脏器指数。小鼠症状、体征观察指标见表1。

2.4 小鼠给药后症状小鼠灌胃给药后，密切观察给药当天4 h内各组小鼠的症状，并连续观察14 d。实验结果表明：给药后30 min内，小鼠静卧抱团，闭眼不动，无叫声异常、流涎、流涕、呼吸困难、腹泻等现象；但30 min后，小鼠大多逐渐恢复正常活动，在鼠笼内攀爬窜动，主动进食饮水；观察14 d期间，小鼠排便恢复正常，由起初给药后的黑灰色转变为正常的豆黄色，活动自如，进食良好，毛色正常，观察期间无小鼠死亡。

2.5 小鼠体重变化小鼠给药后，连续观察14 d并称取各组小鼠体重。实验结果表明：观察14 d期间给药组小鼠体重正常增长，与空白组比较，体重变化均无显著性差异（P＞0.05），见表2。玳玳果降脂提取物MTD实验小鼠体重自身差异曲线图见图1、图2。

表1小鼠症状、体征观察指标

图1 MTD试验雄性小鼠体重变化图

2.6 小鼠脏器指数小鼠在给药后第14天称取体重后，脱颈处死，进行解剖，肉眼观察心、肝、脾、胃、肾、胸腺等重要脏器变化，称取各脏器湿重，计算脏器指数。脏器指数＝脏器湿重（mg）／小鼠体重（g）。实验结果表明：小鼠实质器官肉眼观察大致正常，无心肺瘀血，无肝脾肿大；给药组小鼠各主要脏器的质地、颜色，与空白组小鼠各脏器的质地、颜色比较无异常，2组脏器指数比较，无显著性差异（P＞0.05），见表3。

3 讨论

3.1 课题组以往研究表明：玳玳果含有黄酮等活性物质，具有较好药理和食疗作用，由闽产玳玳果制备的玳玳果总黄酮提取物具有显著的降脂、清除自由基及抗氧化作用，具有良好的药用开发价值［2－4］。

3.2 预实验以玳玳果降脂提取物可以灌胃的最大浓度（0.8 018 g／mL），小鼠可承受的最大体积（0.4mL／10 g）灌胃给药1次，连续观察7 d，无Dm值（100%死亡率），故玳玳果降脂提取物的急性毒性试验选用最大耐受量（MTD）法。另外，给药组小鼠在给药后开始几天，体重增加缓慢甚至减轻，主要原因是对小鼠的满负荷灌胃导致的，经过几天适应期后，小鼠体重逐渐恢复正常。

3.3 玳玳果降脂提取物小鼠急性毒性试验经灌胃口服给药未能测出玳玳果降脂提取物的LD50，根据《中药、天然药物急性毒性研究技术指导原则》［9］选用MTD法测定，结果表明：小鼠对玳玳果降脂提取物的最大耐受量为32.07 g／kg，玳玳果成人（体重以60 kg计）民间食用习惯的日口服最大剂量6.75 g／d，玳玳果降脂提取物的最大耐受量相当于临床用量的285.07倍。一般以小鼠最大给药量相当于成人临床日用剂量的100倍以上为安全的［9］，提示玳玳果降脂提取物的毒性极低或基本无毒，规定剂量下口服用药是安全的。

图2 MTD试验雌性小鼠体重变化图

表3 2组小鼠脏器指数比较（x±s）

［1］陈丹，林超，刘永静，等.代代的研究进展［J］.福建中医药大学学报，2008，18（1）：61-63.

［2］ZENG L J，CHEN D，HUANG Q D，et al.Isolation of a new flavanone from Daidai fruit and hypolipidemic activity of total flavonoids extracts［J］.Natural Product Research，2015，29（16）：1521-1528.

［3］曾令军，陈丹，郑利，等.玳玳黄酮降脂提取物的鉴别及其特殊杂质检测［J］.中国中医药科技，2014，21（1）：42-43.

［4］曾令军，陈丹，郑利，等.玳玳黄酮提取物的质量标准研究［J］.中国药品标准，2013，14（5）：337-341.

［5］陈丹，刘永静.一种玳玳果总黄酮有效部位的制备方法［P］中国：CN201010556341，2011-5-18.

［6］刘永静，陈丹，邱红鑫，等.玳玳黄酮有效部位提取物降血脂作用的研究［J］.中国中医药科技，2013，20（6）：622-623.

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［8］邱红鑫，陈丹，刘永静，等.玳玳果黄酮滴丸对高脂血症大鼠的降血脂作用研究［J］.中国现代应用药学，2011，28（7）：597-601.

［9］国家食品药品监督管理局.药物研究技术指导原则［S］.北京：中国医药科技出版社，2006：209-216.

R285.5

A

1000-338X（2017）04-0037-03

2017-05-27

福建省医学创新项目（2016-CX-45）；福建省科技计划项目（2010Y2004）。

陈红（1966—），女，副主任医师，主要从事老年病学研究。

陈丹（1961—），女，博士，教授。E-mail：gscd2@163.com