结核活动性与T细胞亚群及斑点试验的临床分析

刘洪璐，刘梅艳，陆霓虹

（昆明市第三人民医院 呼吸内科，云南 昆明 650041）

肺结核（pulmonary tuberculosis，TB） 发展历史悠久，严重危害人类的健康和生命，全球分布广泛。2017年，全球约有1000万结核新发病例，在10万人中有133例结核患者。从2011-2016年我国肺结核发病人数及死亡人数、发病率均呈逐年缓慢下降趋势。我国人口基数大，是结核病高发国家，虽然结核病防治工作日渐成效，但依旧任重道远。据统计我国2016年结核发病人数仍有83.6万，发病率约为61/10万[1]，位居世界第三，因此，结核早期诊断及防治工作尤为重要。

结核免疫以细胞免疫为主，结核杆菌作用于T细胞使其致敏并释放出多种淋巴因子如干扰素（Interferon，IFN） 和白细胞介素（Interleukin，IL）等[2]，能激活巨噬细胞，促进细胞内溶酶体含量增加、酶活性增高，使活化的巨噬细胞吞噬能力增强[3]，对杀灭原发灶中的结核杆菌起着显著作用。结核分枝杆菌可诱导强烈的细胞免疫反应，因此，检测结核分枝杆菌特异的T淋巴细胞可作为检测感染的一种新路径。结核特异性T细胞IFN-γ体外释放试验 （T cell-based IFN-γ release assays，IGRA）近年来应用广泛[2]。其原理是通过检测机体的细胞免疫功能来判断是否存在结核分枝杆菌感染。人体初次感染结核分枝杆菌后使T淋巴细胞转化为记忆T淋巴细胞，当人体再次接触结核分枝杆菌后，会迅速产生效应T淋巴细胞，释放以γ-干扰素（IFN-γ）为主的一系列细胞因子。在机体外用分枝杆菌特异抗原刺激受试者外周血单个核细胞，测定分离至全血或单个核细胞的INF-γ释放水平，可以判断是否有MTB感染。结核感染T细胞斑点试验（T-SPOT.TB）简称斑点试验是常用的一种IGRA。

因此，结核的发生与患者的免疫状况密切相关，结核斑点试验亦与机体免疫相关，但它们之间的关系究竟如何，是否能指导临床早期甄别或定性肺结核，目前尚未有研究报道。本研究拟探索肺结核患者的细胞免疫状态、斑点试验与结核活动性之间的相关关系，为早期甄别活动性肺结核患者提供临床依据和诊疗策略。

资料与方法一、研究对象 回顾统计分析了昆明市第三人民医院2018年4月-11月于呼吸与危重症医学科住院的临床诊断肺结核的103例住院患者，其中男性56例，女性47例。患者年龄在13～94岁，中位年龄44岁，青年（＜40岁）44例，中年（40岁～64岁） 36例，老年（≥65岁） 23例。

二、研究方法 患者入院后完善相关检查，最终临床诊断为肺结核患者或既往感染者。患者入院后均进行了CT检查确认肺部病变，完善了斑点实验，T细胞免疫实验等检查。

三、数据分析 运用SPS22.0统计软件进行数据的统计分析，数据的表示：正态分布数据使用均数±标准差表示，非正态分布数据使用中位数（四分位间距）表示。数据之间两两比较：正态分布资料使用t检验，非正态分布使用非参数检验中的Mann-Whitney检验比较两组数据之间的差异是否具有统计学意义。数据之间的相关性比较：两计量资料之间的相关性分析使用Pearson相关性检验，二分类资料之间、二分类资料与计量资料之间的相关性分析使用Spearman相关性检验，以P＜0.05为差异具有统计意义。经比较分析，所有数据中仅患者CD3+、CD4+T细胞数、CD4+T细胞百分比的分布符合正态分布，其他数据均不符合正态分布。

结果一、斑点试验、活动结合、细胞免疫之间两两相关性比较

经两两比较分析，T-SPOT试验抗原A及抗原B 之间显著相关 （P＜0.001）；CD3+，CD4+，CD8+的T细胞数目之间两两均有相关性，P＜0.01。此外，结核的活动性与痰检阳性率有关（P＜0.05）；结核的活动性与CD3+T细胞数量以及CD4+T细胞百分比有关（P＜0.05）；以上各组具体相关系数见表1。斑点试验阳性情况（抗原A、抗原B数量均≤3个即认为斑点试验阴性）、斑点试验抗原A、抗原B具体数值与细胞免疫缺乏（T细胞亚组任意指标数低于正常参考值范围）、CD3+，CD4+，CD8+具体数量及百分比均无相关关系；结核活动性与斑点试验之间也无相关关系。

二、活动性肺结核与陈旧性肺结核之间的比较

因肺结核活动性与CD3+T细胞数目有相关关系，按活动性肺结核、陈旧性肺结核将患者分为2组，其中活动性肺结核有88例，陈旧性肺结核有15例。CD3+T细胞在活动性肺结核患者血液中的平均含量为（1004.2±449.6） 个/μl，在陈旧性肺结核为（1273.5±477.6） 个/μl，在活动性肺结核患者血液中的数量低于陈旧性肺结核患者（P＜0.05）；CD4+T%在活动性肺结核患者血液中的平均比率为36.29%±10.7%，在陈旧性肺结核为43.33%±9.24%，在活动性肺结核患者血液中的数量低于陈旧性肺结核患者（P＜0.05）。其余因素与结核活动性无明显相关关系，具体参数见表2。

讨论肺结核仍是严重威胁我国人口健康的呼吸道传染病之一。早期卡介苗的诞生在一定程度上降低了我国结核的感染率，但随着耐药结核的产生和播散，越来越多的难治性结核威胁着人们的生命健康。及时发现、诊断肺结核患者，做好呼吸道隔离对降低肺结核的发病率、耐药结核感染率以及患者死亡率均有重要的意义。

斑点实验试验是近年来运用较多的结核相关检查之一，在诊断结核感染方面具有较好的灵敏度和特异性[4]。斑点实验包括检测抗原A及抗原B，抗原A为分泌抗原6（ESAT-6），抗原B为滤液蛋白10（CFP-10），抗原A和抗原B在检测过程中分开计数，最后根据阳性斑点数即可推断样本中结核致敏的T细胞数量[5]。本研究也表明抗原A和抗原B的表达性是一致的，其呈正相关关系。结核分枝杆菌早期分泌ESAT-6和CFP-10在动物模型中具有较强的T细胞免疫性，是结核疫苗的候选因子[6]。然而，也有大量证据表明这些抗原蛋白在结核分枝杆菌感染过程中是有毒因子[7]。已有研究表明，ESAT-6通过溶解上皮细胞和巨噬细胞[8]和破坏噬菌体脂质体，减少巨噬细胞产生IL-12，从而抑制抗原呈递细胞功能，使MTB及其产物逃逸噬菌体[9]，并促进MTB的细胞内传播[8]。也有研究表明，ESAT-6直接抑制人T细胞IFN-G的产生[10]。因此，斑点试验抗原A及抗原B与人体免疫状况有关，也应与T细胞亚群有一定的关系。但在本实验中，通过统计分析，斑点试验阳性率、抗原A或抗原B数量与T细胞亚群各种数据间均无明显相关关系，其主要原因考虑与检验方法有关。在斑点试验检测过程中，收集外周血过滤出其中的免疫细胞，通过浓集使T细胞总数达到一定数量后才进行相关检测分析。这种方法对提高细胞免疫缺陷患者斑点试验阳性率有较高的帮助，但对于免疫缺陷患者，原本较少的T细胞通过浓集，达到了和免疫正常患者同样的数量级，因此免疫缺陷患者和正常患者的斑点试验并无明显差异。今后或许可通过收集等量血液，浓缩T细胞后检测抗原A和抗原B含量，这样的试验方式或许可以发现其与T细胞亚群之间的关系。

表1 斑点试验、活动结合、细胞免疫之间的关系指标

表2 活动性肺结核与陈旧性肺结核之间的抗原和淋巴细胞比较

活动性肺结核与陈旧性肺结核患者PPD试验与斑点试验常为阳性，CT显示病灶有时候也很难区分是否活动。有的活动性结核患者并无典型的结核中毒症状，因此临床区分结核的活动性较为困难，直接影响了结核的治疗。而免疫缺陷患者更易感染结核，因此，本研究从细胞免疫方面入手分析T细胞亚群与结核活动性的情况。

T细胞在细胞免疫中发挥着重要的作用，根据T细胞表面的生物标记T细胞可以划分为不同的亚群。几乎所有成熟的T细胞表面都有表达CD3+表达[11]。Ti/Th细胞（以CD3+CD4+表达为特征） 是免疫应答中主要的反应细胞，在免疫过程中辅助其他淋巴细胞，包括B细胞的成熟和细胞毒性T细胞和巨噬细胞的激活。Ts/Tc细胞（CD3+CD8+）通过结合主要组织相容性复合物I类相关抗原来识别其目标，并破坏病毒感染细胞和肿瘤细胞[12]。CD4+/CD8+比值可直接反映机体细胞免疫功能状态，它们之间既相互促进又相制约。因此CD3+T细胞代表了成熟的T细胞数量，CD4+T%即T细胞中辅助T细胞的百分比。本研究发现CD3+T细胞数量及CD4+T%与结核活动性有相关关系；在活动性肺结核患者血液中，CD3+T细胞含量和CD4+T%比率低于陈旧性肺结核。换言之，成熟T细胞数量减少，辅助T细胞比例减少与结核的活动相关。在结核杆菌侵袭人体过程中需要大量的杀伤T细胞，即CD8+T细胞参与，因此辅助T细胞比率相对减少，符合细胞免疫过程。但CD8+T%的百分比与结核活动并无负相关关系，这可能有其他作用机制，或是因样本量不足导致的。今后可以扩大样本量进行相关统计研究其有无相关关系。或许从T细胞亚组分析方面能帮助我们更准确快速的判断患者是否处于结核活动，是否需用药治疗。此外，在本研究中肺结核活动性与痰检阳性率相关，这符合活动性结合的诊断，进一步证实本研究的可靠性。

综上所述，患者CD3+T细胞数量及CD4+T%的细胞免疫状况可能与肺结核的活动性有关，有望作为临床鉴别结核活动性的参考指标。