癌胚抗原mRNA、人中性粒细胞多肽1-3 联合检测在结直肠癌诊断中的价值

陆 屸，陈 颢，符 炜，张 林，陆 晓，邵利坚

（1 常熟市第一人民医院肿瘤科，江苏 215500；2 复旦大学附属肿瘤医院中西医结合科，上海 200032）

结直肠癌是一种高发病率、高病死率的疾病。因其具有转移性，故在结直肠癌的诊治中早期确诊起至关重要的作用。我院2009 年8 月—2011 年12 月采用巢式逆转录实时PCR 技术（nested RT-PCR 法）检测癌胚抗原信使核糖核酸（CEAmRNA），采用酶联免疫测试法（ELISA 法）检测人中性粒细胞多肽（human neutrophil peptides, HNP1-3），观察结直肠癌患者术前与术后的表达，探讨2 种技术及应用二者相结合的平行与系列相关检测在结直肠癌的定性、分期，乃至在预测预后等方面评估的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 结直肠癌患者70 例为观察组，其中男44 例，女26 例，年龄28~70 岁，平均47.5±16.8岁。术前未放化疗，术后经病理切片证实。同时选择经内镜取活组织检查确诊无癌症的同期就诊者70例为对照组，其中男39 例，女31 例为对照组，年龄30～68 岁，平均45.8±19.2 岁。两组在性别、年龄等一般资料的差异无统计学意义（P＞0.05）。结直肠癌70例患者的肿瘤部位：结肠37 例、直肠33 例；病理分化程度：低18 例、中37 例、高15 例；Dukes 分期：A期14 例、B 期24 例、C 期22 例、D 期10 例；淋巴结转移情况：是32 例、否38 例；肝转移8 例。

1.2 方法 （1）主要试剂及设备：100bp DNA Ladder （Bomeike ltd 公司, 天津）；Taq PCR MasterMix（Bioteke Corporation ltd 公司, 北京）；cDNA Synthesis Kit（Biocoen Corporation ltd 公司, 北京）；XL01395 HNP1-3 Kit（Xinle Corporation ltd 公司, 上海）。仪器ChemWell2910（Awareness 公司, 美国），MultiGene Optimax PCR（Labnet 公司,美国）。（2）标本采取：空腹状态下，结直肠癌患者在术前1 天抽取外周静脉血6mL，EDTA 抗凝及3mL 外周静脉血置于无菌试管分离血浆。对照组标本采取方法相同。（3）实验测量：本实验分别采用Nested RT-PCR 法检测CEAmRNA 的表达，采用ELISA 法检测HNP1-3 的表达。

2 结果

2.1 临床及病理特点 结直肠癌患者外周血清CEAmRNA 阳性表达与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度无关，差异无统计学意义（均P＞0.05），与淋巴结转移及Dukes 分期有关（均P＜0.05）。结直肠癌患者外周血HNP1-3 水平与性别、年龄、肿瘤部位、分化程度无关，差异无统计学意义（均P＞0.05），与淋巴结转移及Dukes 分期有关（均P＜0.05）。见表1、表2。

2.2 外周血清CEAmRNA 与HNP1-3 单一及联合检测的诊断价值 结直肠癌70 例患者术前外周血清CEAmRNA 表达阳性37 例，对照组70 例中阳性1 例。外周血清CEAmRNA 对结直肠癌的诊断敏感度/特异度见表3，假阳性为1.43%（1/70），假阴性为47.14%（33/70）。对HNP1-3 的表达的判定中，以正常人95%百分位数(14.46 ng/nL)为正常参考值的上限指标，大于14.46 ng/nL 时则视为阳性结果。对照组70 例中阳性1 例，结直肠癌70 例中阳性42 例。HNP1-3 对结直肠癌诊断敏感度，特异度见表5，假阳性为1.43%（1/70），假阴性为40%（28/70）。在CEAmRNA 与HNP1-3 联合检测中发现：以CEAm-RNA 或HNP1-3 中任一指标为阳性定义该患者为阳性时，敏感度，特异度见表3；以CEAmRNA 和HNP1-3 均阳性时，敏感度，特异度见表3，在与单一的CEAmRNA 法及单一的HNP1-3 法检测相比，平行及系列关联法检测具有更好的效果见表3，提示HNP1-3 对结直肠癌的诊断有一定的作用。

表1 结直肠癌术前外周血清CEAmRNA 阳性表达病例的临床及病理特点（例，%）

表2 术前HNP1-3 浓度与肿瘤转移、分化程度、Dukes 分期、及病理特点等因素的关系

表3 外周血清CEAmRNA 与HNP1-3 单一及联合检测的诊断价值（%）

3 讨论

结直肠癌的发生是由于多个致病因素，在多个步骤及阶段后出现一系列症状的病理过程[1]。它包括遗传易感性等内因，理化因素和生物致癌因素等外因，以及内外因协同作用。2002 年世界卫生组织公布的资料显示：结直肠癌在男性癌症的发病率为第4 位，女性中为第3 位，为一类高发病率、高病死率的恶性疾病，病死率约50%[2]。早期诊断对疾病的治疗和预后着重要的作用，在根治性手术后又因早期复发、早期转移等在病理学及临床中被证实较困难。这使一部分患者确诊较晚，错过了最佳治疗时期，导致患者预后差乃至于死亡[3]。近年随着结直肠癌临床诊断要求的提高，肿瘤分期及组织形态学与细胞学检测难以适应临床需要，而细胞学的发展为结直肠癌的临床诊断提供了一条新途径。

胃肠道恶性肿瘤癌细胞从原发灶脱落后，早期可经骨髓、血液循环及淋巴转移，并在循环中成为循环肿瘤细胞，进而造成复发和转移[4]。癌胚抗原由Gold 与Freedman 在1965 年最早发现[5]，是国际公认的肿瘤标记物[6]。但一系列研究发现相当一部分结直肠癌患者癌胚抗原阴性[7]。而癌胚抗原mRNA 在外环境易破坏，不稳定，难以被检测出[8]，仅在肿瘤细胞存在和出现血性转移时可被检测出，在正常人体内不表达或仅微量表达[9]，而在上皮来源的恶性肿瘤中尤其在胃肠道的癌症中有较高的表达[10]。

本研究中，在对结直肠癌患者的临床及病理特点与CEAmRNA 在外周血中的表达程度的分析，发现结直肠癌患者的年龄、性别、部位及分化程度与CEAmRNA 在外周血中的表达程度无明显相关，而与Dukes 分期及是否有淋巴结转移明显相关。提示年龄、性别、部位及分化程度对结直肠癌外周血CEAmRNA 影响小，而Dukes 分期及是否有淋巴结转移对CEAmRNA 有较大影响，与陈梓宏等[11-12]研究相一致。提示决定结直肠癌患者预后的最重要指标是肿瘤的浸润深度与淋巴结转移的程度。Dukes分期B、C 期结直肠癌外周血CEAmRNA 的表达较显著，敏感性为71.88%，而A 期与B 期时的阳性率仅为36.84%，提示外周血清CEAmRNA 对结直肠癌的晚期诊断有作用，在早期诊断特异性不高。同时在有结直肠癌肝脏转移时表达更为显著，这与既往研究相一致[12]。也证明在对结直肠癌预后的判定中CEAmRNA 在外周血中的表达有非常重要的作用。

人中性粒细胞多肽（Human neutrophil peptides ,HNP）又称人中性粒细胞防御素，为防御素的α 型。HNP1-3 为HNP 3 种亚型，是中性粒细胞主要的杀菌成分[13]，存在于人体免疫细胞及肠道粘膜上皮细胞中。在正常人体细胞外较少甚至不表达[14]，在结直肠癌细胞外表达增加[15]。本次研究发现HNP1-3 水平与结直肠癌患者年龄、性别、部位及分化程度无明显相关，但随着Dukes 分期由A 期至D 期依次而增高，且在早期即有所升高。有淋巴结转移时，HNP1-3的表达远高于正常对照组。提示年龄、性别、部位及分化程度对结直肠癌HNP1-3 影响小，而Dukes 分期及是否有淋巴结转移则对HNP1-3 有较大影响。提示与CEAmRNA 一样，HNP1-3 表达对结直肠癌预后判定也有非常重要的作用，并且结直肠癌早期诊断中也有一定价值。

在结直肠癌中，外周血CEAmRNA 或HNP1-3的单一检测虽有较好的效果[16-19]，然而受制于单一检测的敏感性不高，难以发挥其更大的作用。故本研究探讨采用2 种检测相结合的平行联测法，及系列联测法在结直肠癌的诊断中的应用。在平行联测法检测过程中，即认定CEAmRNA 或HNP1-3 的判定中有1 项阳性时即为阳性判定，敏感性为77.14%，较单一检测更加敏感；在系列联测法检测过程中，即认定CEAmRNA 和HNP1-3 判定中2 项均为阳性时即为阳性的判定，其特异性为100%，敏感度为42.85%，较单一检测更为准确。由此可见采用CEAmRNA 与HNP1-3 的平行及系列联测法可更加敏感、更为准确的进行结直肠癌的诊断。

本次试验证实，CEAmRNA 与HNP1-3 检测的平行及系列联测法在结直肠癌的诊断及判定预后中有较好的效果，值得进一步推广应用。

[1] Smigal C, Jemal A, Ward E, et al. Trends in breast Cancer by race and ethnicity： update 2006[J]. CA Cancer J Clin,2006, 56(3)： 168-183.

[2] Jemal A, Siegel R, Ward E, et al. Cancer statistics, 2007[J].CA Cancer J Clin,2007, 57(1)： 43-66.

[3] Tschmelitsch J, Klimstra DS, Cohen AM. Lymph node micrometastases do not predict relapse in stage II colon Cancer[J]. Ann Surg Oncol, 2000, 7(8)： 601-608.

[4] Shimada R, Iinuma H, Tamura J, et al. Usefulness of CTCs in tumor drainage vein blood as a biomarker for prognosis in colorectal Cancer patients with Dukes' stage B and C[J]. Gan To Kagaku Ryoho, 2012, 39(12)： 1763-1765.

[5] Flagella M, Bui S, Zheng Z, et al. A multiplex branched DNA assay for parallel quantitative gene expression profiling[J]. Anal Biochem, 2006, 352(1)： 50-60.

[6] Chen SL, Bilchik AJ. More extensive nodal dissec tion improves survival for stages I to III of colon Cancer： a population-based study[J]. Ann Surg, 2006, 244(4)： 602-610.

[7] Kronberg U, López-Kostner F, Soto G, et al. Detection of lymphatic micrometastases in patients with stages I and II colorectal Cancer： impact on five-year survival[J]. Dis Colon Rectum, 2004, 47(7)： 1151-1157.

[8] Lv M, Mou Y, Wang P, et al. Diagnostic and predictive role of cell-free midkine in malignant pleural effusions[J].J Cancer Res Clin Oncol, 2013,139(4)：543-549.

[9] Lesterhuis WJ, De Vries IJ, Schreibelt G, et al. Immunogenicity of dendritic cells pulsed with CEA peptide or transfected with CEA mRNA for vaccination of colorectal Cancer patients[J]. Anticancer Res, 2010, 30(12)： 5091-5097.

[10] Sadahiro S, Suzuki T, Maeda Y, et al. Detection of carcinoembryonic antigen messenger RNA-expressing cells in peripheral blood 7 days after curative surgery is a novel prognostic factor in colorectal Cancer[J]. Ann Surg Oncol,2007, 14(3)： 1092-1098.

[11] 陈梓宏，梁荣，赖振南，等.大肠癌患者外周血CEAmRNA和CK20mRNA 的联合检测及临床意义[J].四川肿瘤防治，2007，20（2）：100-102.

[12] Chen ZH, Liang R, Lai ZN, et al. Expressions of CEAmRNA and CK20mRNA in peripheral blood of patients with colorectal Cancer and its clinical significance[J]. SiChuan Journal of Cancer Control, 2007, 20(2)： 100-102.

[13] Yadegarazari R, Hassanzadeh T, Majlesi A, et al. Improved real-time rt-PCR assays of two colorectal Cancer peripheral blood mRNA biomarkers： a pilot study[J]. Iran Biomed J,2013, 17(1)： 15-21.

[14] Albrethsen J, MØller CH, Olsen J, et al. Human neutrophil peptides 1, 2 and 3 are biochemical markers for metastatic colorectal Cancer[J]. Eur J Cancer, 2006, 42(17)： 3057-3064.

[15] Wilde CG, Griffith JE, Marra MN, et al. Purification and characterization of human neutrophil peptide 4, a novel member of the defensin family[J]. J Biol Chem, 1989, 264(19)： 11200-11203.

[16] Mothes H, Melle C, Ernst G, et al. Human neutrophil peptides 1-3--early markers in development of colorectal adenomas and carcinomas[J]. Dis Markers, 2008, 25(2)： 123-129.

[17] Albrethsen J, BØgebo R, Gammeltoft S, et al. Upregulated expression of human neutrophil peptides 1,2 and 3(HNP 1-3)in colon Cancer serum and tumours：a biomarker study[J].BMC Cancer, 2005,5：8.

[18] Melle C, Ernst G, Schimmel B, et al. Discovery and identification of alpha-defensins as low abundant, tumor-derived serum markers in colorectal Cancer [J].Gastroenterology,2005, 129(1)： 66-73.

[19] Kanellos I, Zacharakis E, Kanellos D, et al. Prognostic significance of CEA levels and detection of CEA mRNA in draining venous blood in patients with colorectal Cancer[J].J Surg Oncol, 2006, 94(1)： 3-8.