半夏及其易混品的DNA分子鉴定

冯　图，何　洋，阮培均

(1. 贵州工程应用技术学院 生态工程学院，贵州 毕节 551700；2.四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，成都中医药大学，四川 成都 610075; 3. 成都中医药大学医学技术学院，四川 成都 610075；4. 毕节市中药研究所，贵州 毕节 551700)



半夏及其易混品的DNA分子鉴定

冯图1*，何洋2,3，阮培均4

(1. 贵州工程应用技术学院 生态工程学院，贵州 毕节 551700；2.四川省中药资源系统研究与开发利用重点实验室省部共建国家重点实验室培育基地，成都中医药大学，四川 成都 610075; 3. 成都中医药大学医学技术学院，四川 成都 610075；4. 毕节市中药研究所，贵州 毕节 551700)

基于ITS、matK、trnL-trnF、rpl32-trnL和rps16序列对栽培半夏及其易混品开展DNA条形码鉴别研究，结果表明：ITS、rps16序列可作为DNA条形码用于半夏及其易混品的鉴别研究中，matK、trnL-trnF序列可作为天南星科不同属间DNA条形码或条形码组合候选序列鉴别半夏及其邻近属植物，rpl32-trnL序列可作为鉴别半夏及其易混品的DNA条形码候选序列。

DNA条形码；半夏；易混品；鉴别

半夏(Pinelliaternata(Thunb.) Breit.)，为天南星科(Araceae)半夏属植物，块茎圆球形，直径1-2 cm，具须根。半夏属在全世界共有9种，中国均有分布，其中7种为中国特有种，中国东部为半夏属植物全球多样性中心[1-2]。《中华人民共和国药典》(2015版)收载半夏入药，其来源为半夏的干燥块茎，具有燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结之功效，入药用于治疗湿痰寒痰、咳喘痰多、痰饮眩悸、呕吐反胃等[3]。半夏是一味常用大宗药材，不仅供中医临床配方使用，也是多种中成药的原料[4]，其使用量较大。然而，由于野生半夏遭到大量采挖且生态环境遭到破坏，野生半夏资源不断减少，加之半夏在种植栽培过程中规范化、标准化不够，半夏资源量和产量不断减少，不能完全满足药材市场需要，正品半夏在药材市场常出现同属或同科伪品混用的现象[4-6]。由于与半夏块茎的形态相似性，中药材市场上半夏的混伪品主要有同属植物虎掌(Pinelliapedatisecta)、滴水珠(Pinelliacordata)以及犁头尖属鞭檐犁头尖(Typhoniumflagelliforme)、斑龙芋属独角莲(Sauromatumgiganteum)、天南星属一把伞南星(Arisaemaerubescens)[7]。

目前对半夏及其易混品的鉴别主要采用显微鉴别、薄层层析、紫外光谱、HPLC等方法，但这些方法不同程度存在耗时较长、稳定性不强、依赖主观性或重复性差等缺点，不能快速、准确地鉴别半夏及其易混品[6-7]。DNA barcoding (DNA条形码)技术是基于物种在遗传特性上的相对稳定性，用一段或几段标准DNA 序列作为分子标记来快速、准确地进行物种鉴别的技术，不受环境因素影响以及样品形态和材料部位的限制，具有客观、稳定、重复性强的特点以及较强的通用性及实用性，对中药材及其易混品的鉴别提供重要手段[7-8]。

本研究基于nrDNA ITS序列及叶绿体matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列对采自不同地区栽培半夏及其混伪品进行DNA条形码鉴别研究，分析不同序列是否适宜对半夏及其易混品进行DNA条形码鉴别，以期为半夏及其易混品的分子鉴别提供参考依据。

1　材料与方法

1.1材料来源

实验材料来自贵州省毕节市不同地区栽培半夏植株，采集新鲜植株叶片材料后用硅胶快速干燥，经四川大学生命科学学院余岩副教授鉴定，材料及序列详细信息见表1。

表1　样品及序列信息

1.2研究方法

1.2.1DNA提取、片段扩增和测序采用2×CTAB法提取硅胶干燥植株材料总DNA[9]，分别选用ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF引物扩增序列，引物信息见表2。PCR扩增反应采用50 μL反应体系，扩增程序为94℃预变性3 min，94℃预变性1 min，48-55℃退火1 min，72℃延伸90 s(共30个循环)，72℃延伸5 min后 10℃保存。PCR产物用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰单一且片段大小正确的扩增产物由英潍捷基(上海)贸易有限公司进行双向测序(见表2)。

1.2.2序列分析及处理根据 Genbank中半夏属植物及半夏易混品相应序列进行建树，建树所用序列号及样品编号详见图中物种名后括号内。利用MEGA6.06[15]对序列进行比对后人工校正，构建邻接树(neighbor-joining，NJ)，并通过10 000次重复bootstrap计算每个分支自展支持率，所有NJ严格一致树均只保留50%以上自展支持率分枝。利用Genbank中blastn 功能比对所得测序序列，并利用DnaSP 5.0[16]对所扩增序列片段核苷酸多态性进行统计分析，分析结果见表3。

表2　序列扩增引物信息

表3　扩增序列分析信息

根据Ohi-Toma[17]等对天南星科植物系统发育的研究结果，建树分析选取芋(Colocasia esculenta)相应序列作为外类群，芋ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列号分别为：AY081000，AM920622，JN105690，JQ237159，AY555184。

2　结果与分析

2.1序列分析

本研究对采自毕节市不同地区的的栽培半夏植物样品的核基因ITS片段及4个叶绿体DNA片段(matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF)进行了PCR扩增及测序，测序成功率为100%，共获得30条序列。序列分析结果表明：ITS序列GC含量最高，达66.6%，rpl32-trnL序列GC含量最低，为24.6%；rps16序列核苷酸多样性最高，为0.0050，matK序列核苷酸多样性最低，为0.0007； rpl32-trnL序列中插入(缺失)碱基数最多，为13个，ITS序列中无插入(缺失)碱基；matK序列K2P(Kimura 2-parametyer)遗传距离变化范围最小，为0.0012，ITS、rps16序列K2P遗传距离变化范围最大，均为0.0046。

2.2半夏及其易混品不同序列遗传距离分析

通过对半夏及其邻近属物种不同序列遗传距离分析结果表明：半夏种内ITS、matK、rpl32-trnL、rps16、trnL-trnF序列遗传距离从0到0.0124不等，其中trnL-trnF序列遗传距离为0。半夏属内物种trnL-trnF序列遗传距离最小，遗传距离变化范围最大为ITS序列(表4)。半夏与天南星属、犁头尖属、斑龙芋属不同序列遗传距离变化范围均大于半夏种内序列遗传距离，部分物种因无相关序列，故未做比较。

表4　半夏及其邻近属物种不同序列遗传距离分析

2.3半夏及其易混品不同序列建树分析

基于ITS序列构建半夏及其易混品NJ一致树表明(图1)，一把伞南星与半夏属植物分别聚为一支，自展支持率均为100%，其中半夏聚为一支，与其他半夏属植物分开，自展支持率达99%。基于rps16序列的半夏及其易混品NJ一致树表明(图2)，半夏属、天南星属、斑龙芋属植物分别聚为一支，所有半夏聚为一支，且自展支持率达64%。

图1　基于ITS序列的半夏及其易混品NJ一致树

图2　基于rps16序列的半夏及其易混品NJ一致树

利用matK序列构建的半夏及其易混品NJ一致树表明(图3)，半夏属植物、一把伞南星、独角莲、鞭檐犁头尖分别聚为一支，且自展支持率均为95%以上。天南星属植物聚为一支，自展支持率为99%.斑龙芋属植物与犁头尖属植物聚为一支，自展支持率为60%，且在此分支内斑龙芋属植物与犁头尖属植物各自聚为一支，自展支持率分别为95%和99%。但在半夏属植物分支内，半夏与虎掌等其他半夏属植物形成多个平行分支，未能完全鉴别开半夏与其他同属植物。

利用matK序列构建的半夏及其易混品NJ一致树表明(图3)，半夏属植物、一把伞南星、独角莲、鞭檐犁头尖分别聚为一支，且自展支持率均为95%以上。天南星属植物聚为一支，自展支持率为99%.斑龙芋属植物与犁头尖属植物聚为一支，自展支持率为60%，且在此分支内斑龙芋属植物与犁头尖属植物各自聚为一支，自展支持率分别为95%和99%。但在半夏属植物分支内，半夏与虎掌等其他半夏属植物形成多个平行分支，未能完全鉴别开半夏与其他同属植物。

利用trnL-trnF序列构建的半夏及其易混品NJ一致树表明(图4)，半夏属植物聚为一支，自展支持率达97%，但独角莲、一把伞南星、犁头尖属植物与半夏属植物形成多个平行分支，未能区分开来。利用rpl32-trnL序列构建的半夏NJ一致树表明(图5)，半夏属内不同半夏样品能被有效鉴别开来且自展支持率较高，均大于60%。

图4　基于trnL-trnF序列的半夏及其易混品NJ一致树

图5　基于rpl32-trnL序列的半夏样品NJ一致树

3　讨论

生命条形码联盟植物工作组推荐使用PWG距离法(单独计算每个物种的遗传距离) 和构建NJ 系统聚类树(Tree-Building) 法，评估不同条形码序列对物种的鉴别力。采用PWG距离法时，只有被鉴定物种种间最小的遗传距离大于种内最大的遗传距离时才表示成功鉴定物种，采用系统聚类树(Tree-Building)方法时，只有同一个物种的不同个体在构建的NJ 系统树上形成单系分支才表示成功鉴定物种[18-19]。

郑司浩等[6]利用ITS、ITS2、psbA-trnH、rbcL和matK序列对半夏及其伪品一把伞南星进行了DNA条形码鉴别研究，结果表明：matK和rbcL序列为鉴别半夏属及其伪品的较理想条形码组合。张雅琴等[7]采用ITS2 序列对中药材半夏及其混伪品虎掌、独角莲、滴水珠、鞭檐犁头尖、一把伞南星进行了DNA 条形码鉴定研究，结果表明：ITS2 序列能准确、稳定鉴定中药材半夏药材及其混伪品。张乐容等[20]对中国半夏属5种植物trnL-trnF序列进行了测序并构建NJ树，结果表明：半夏属药用植物物种分化不完全，序列进化不一致，其中虎掌和半夏属其他物种间的遗传差异较大。

本研究中经分析表明，ITS、rps16序列种间最小的遗传距离均大于种内最大的遗传距离(表4)，且在NJ树中所有半夏聚为单系分支，自展支持率分别为99%和64%，表明ITS、rps16序列能作为DNA 条形码成功鉴别半夏及其易混品。matK、trnL-trnF序列种间最小的遗传距离均大于种内最大的遗传距离，在构建的NJ树中，它们未能成功鉴别半夏与其他同属植物，但半夏属植物形成的分支与天南星属、斑龙芋属、犁头尖属等分支明显区别开来，自展支持率分别为99%和97%。成功鉴别半夏属与其他属植物。

理想的DNA条形码应具有可以区分物种的足够变异和分化，种内变异必须足够小；应有高度保守的引物设计区以便于设计通用引物；序列长度便于DNA提取和PCR扩增，尤其是对部分降解DNA的扩增[21]。目前国内外学者对植物DNA条形码开展了诸多研究，但很难发现一个DNA序列片段能区别同科或同属所有物种。因此，学者根据不同的研究对象推荐不同的DNA 序列组合以准确鉴别中药材及其易混品。本研究结果表明，ITS、rps16序列可作为DNA条形码用于半夏及其易混品的鉴别研究中，matK、trnL-trnF序列可作为天南星科不同属间DNA条形码或条形码组合候选序列鉴别半夏及其邻近属植物，rpl32-trnL序列长度适中，有通用引物且易于扩增，可作为鉴别半夏及其易混品的DNA条形码候选序列。但由于本次样本量及Genbank中登录rpl32-trnL序列偏少，有待扩大采样数量后开展后续研究。

致谢：感谢四川大学生命科学学院余岩副教授在样品鉴定、数据处理及分析方面给予的帮助，感谢国家标本平台教学标本子平台(2005DKA21403-JK，http://mnh.scu.edu.cn)提供标本比对参考图片。

[1]中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志(第十三卷第二分册)[M]. 北京: 科学出版社，1979.

[2]Li Heng，Zhu Guanghua，Peter C. Boyce，et al.Araceae. In: Flora of China Editorial Committee(ED)[M]. St. Louis: Missouri Botanical Garden Press，2011.

[3]国家药典编委会，中华人民共和国药典[M]. 北京: 中国医药科技出版社，2015.

[4]李婷，李敏，贾君君，等. 全国半夏资源及生产现状调查[J]. 现代中药研究与实践，2009,23(2):11-13.

[5]魏淑红，彭正松. 半夏类药材研究概况[J]. 中药材，2003，26(11):828-832.

[6]郑司浩，魏文龙，任伟光，等. 基于DNA条形码的半夏属及其伪品分子鉴别[J]. 植物学报，2014，49(6):710-719.

[7]张雅琴，宋明，孙伟，等. 中药材半夏及其混伪品的DNA条形码鉴定研究[J]. 世界科学技术-中医药现代化，2014，16(8):1725-1729.

[8]熊波，赵志礼，倪梁红，等. DNA条形码技术在中药鉴定中的应用、局限性与展望[J]. 中药材，2015，38(10): 2202-2206.

[9]冯图，黎云祥. 几种药用植物基因组DNA 提取方法研究[J]. 毕节学院学报，2011，29 (133): 98-101.

[10]White T J，Bruns T D，Lee S B，etal. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis N，Gelfand D，Sninsky J，White J (eds) PCR-protocols and applications-a laboratory manual[M]. New York: Academic，1990.

[11]Shaw J，Lickey E B，Beck J T，etal. The tortoise and the hare II: relative utility of 21 noncoding chloroplast DNA sequences for phylogenetic analysis[J]. American Journal of Botany, 2005，92(1): 142-166.

[12]Timme R E，Kuehl J V，Boore JL，etal. A comparative analysis of the Lactuca and Helianthus (Asteraceae) plastid genomes: identification of divergent regions and categorization of shared repeats[J].AmericanJournalofBotany, 2007，94(3): 302-312.

[13]Wang Q Z，Zhou S D，Liu T Y，et al. Phylogeny and classification of Chinese Bupleurum based on nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer and rps16[J].ActaBiologicaCracoviensia, 2008，50(2): 105-116.

[14]Taberlet P，Gielly L，Pautou G，et al. Universal primers for amplification of three non-coding regions of chloroplast DNA[J].PlantMolecularBiology, 1991(17): 1105-1109.

[15]Tamura K，Stecher G，Peterson D，etal. MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis version 6.0[J]. Molecular Biology and Evolution, 2013，30(12): 2725-2729.

[16]Librado P，Rozas J. DnaSPv5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J]. Bioinformatics, 2009，25(11): 1451-1452.

[17]Ohi-Toma Tetsuo，Wu Sugong，R.Yadav Shrirang，etal. Molecular Phylogeny of Typhonium sensu lato and Its Allied Genera in the Tribe Areae of the Subfamily Aroideae (Araceae) Based on Sequences of Six Chloroplast Regions [J].SystematicBotany, 2010，35(2):244-251.

[18]CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2009，106(31):12794-12797.

[19]China Plant BOL Group，Li DZ，Gao LM，etal. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer (ITS) should be incorporated into the core barcode for seed plants [J].ProcNatlAcadSciUSA, 2011，108(49):19641-19646.

[20]张乐容，杨在君，欧阳钟鸣，等. 半夏属药用植物trnL-F序列与种间遗传关系分析[J]. 中国农学通报，2012，28(21):81-85.

[21]刘震，陈科力，罗焜，等. 忍冬科药用植物DNA条形码通用序列的筛选[J]. 中国中药杂志，2010，35(19): 2527-2532.

Identification ofPinelliaternataand Adulterants Based on DNA Barcoding

FENGTu1,HEYang2,3,RUANPei-jun4

(1.GuizhouUniversityofEngineeringScience,SchoolofEcologicalEngineering,Bijie,Guizhou551700，China; 2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseofSystematicResearch,DevelopmentandUtilizationofChineseMedicineResources,Co-fundedbySichuanProvinceandMOST,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;3.CollegeofMedicalTechnology,ChengduUniversityofTraditionalChineseMedicine,Chengdu,Sichuan610075,China;4.BijieInstitutionofTraditionalChineseMedicine,Bijie,Guizhou551700,China)

In the present study, DNA barcoding analysis was used to identifyPinelliaternategermplams and their adulterants based on ITS, matK, trnL-trnF, rpl32-trnL and rps16 sequences. The results showed that the ITS and rps16 sequences were suitable for the identification ofPinelliaternategermplasms and their adulterants, and the rpl32-trnL sequences could be the candidatebarcode sequences. The combination of matK and trnL-trnF sequences could be used to identify the germplasms ofPinellia, as well as their relatives of Araceae.

DNA Barcoding;Pinelliaternata; Adulterant; Identification

2016-02-01；

2016-03-16

贵州省教育厅自然科学研究项目“DNA条形码技术在地道中药材鉴定研究中的应用”(黔教科(20090070)；国家科技支撑计划“特色优势中药材保种扩繁及质量标准与质量控制研究”(2015BAI05B03)；毕节学院高层次人才科研基金“乌蒙山区重要药用植物资源调查、鉴别与质量评价研究”(G2012009)；毕节学院自然科学研究项目“五种重要药用植物的DNA指纹图谱研究”(20092023)。

冯图(1982-)，男，四川武胜人，博士，副教授，主要研究方向：植物学、生态学研究；E-mail: fengtu@gues.edu.cn。

Q949.95；S184

A

1008-0457(2016)02-0015-006国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.003