AM真菌离体双重培养研究进展

冉海燕，江　龙

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)



·文献综述·

AM真菌离体双重培养研究进展

冉海燕，江龙*

(贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025)

AM真菌在农业生产用“菌肥”以及重金属污染修复上占据重要地位。AM真菌的生理生化及遗传特性决定了AM真菌的利用方式。离体双重培养法是目前研究AM真菌生物学功能特性的高效便利的途径，利用AM真菌与植物离体转型根进行共生培养探究AM真菌的生长发育过程，为未来利用AM真菌孢子生产AM真菌接种剂提供理论参考。本文综述了近年来国内外AM真菌离体双重培养的研究进展，针对目前AM真菌纯培养存在的问题题提出了相关建议。

AM真菌；离体双重培养；研究进展

丛枝菌根真菌(AM真菌)与植物根系的共生是自然界最广泛的共生关系,它能与80%的陆生植物形成互惠共生体，土壤中AM真菌孢子萌发产生的菌丝通过侵染宿主植物根系形成泡囊-丛枝结构，促进宿主植物从土壤中吸收植物所需的矿质营养，同时AM真菌也将从宿主植物中获取帮助完成自身生长发育周期所需的营养物质[1]。1885年，德国植物生理学和森林学家Frank 首创“菌根”(Fungus-root 即Mycorrhiza) 这一术语，掀起了生物学界科研人员对这一类特殊的有益微生物的研究热潮。AM真菌能促进植物的营养吸收，提高植物的产量与质量，接种AM真菌可明显的提高茶树叶片中N、P、K等含量，可溶性糖、蛋白质含量也有所提高，同时茶叶中茶多酚、氨基酸等物质含量提高，降低了氨酚比[2]；自然条件下接种Glomusversiforme促进了柑橘过时组织的发育，果实中VC含量、酚含量、黄酮含量、矿物质含量等均较未接种的有所提高[3]。AM真菌除了能促进植物的营养吸收，提高植物的产量与质量，在重金属污染修复上发挥重要的作用[4]，在镉污染地黑麦草根围接种AM真菌可缓解镉对黑麦草的毒害作用，对黑麦草根系镉毒害缓解更为明显[5]；根内球囊霉能显著降低紫云英茎和根内镧含量，减少镧对紫云英的毒害[6]；接种摩西球囊霉能够有效缓解镉、铜、砷对金鸡菊和蜈蚣草的毒害等[7]。AM真菌促进植物对土壤中矿质营养的吸收，提高植物的抗逆性以及环境修复上的重要作用，所以AM真菌在农林业生产上具有广泛的应用前景[8]。在生产实践中，AM真菌的作用并未充分发挥，主要原因在于需要大量的AM真菌孢子，目前规模化生产AM真菌接种剂的方法仍不成熟[9]，因此开展AM真菌的生理、遗传特性的研究，最终实现AM真菌接种剂作为安全高效菌肥是AM真菌研究的重要方向[10]。

AM真菌的研究涵盖了菌根的形态、分类、多样性、生物学功能等多方面，其中一个研究重点就是利用植物根段或是植物离体转型根作为寄主进行AM真菌的离体纯培养，获得大量纯净孢子。AM真菌活体专性共生的特性限定了AM真菌不能进行纯培养，离体双重培养是一种安全高效的方法，主要利用植物根系或植物转型根系来建立与AM真菌的共生体系，在共生体系中，希望AM真菌可以完成生活史，并大量产孢。在植物根系或植物转型根系这两种共生体系中，由植物根系建立的共生体系存在生长缓慢，需要添加外源生长调节剂等不利因素；利用土壤细菌发根农杆菌对植物体进行转化得到的植物Ri-TDNA转型根，具有在无激素MS培养基上生长迅速，存活时间久，同时能保持良好的遗传特性，是AM真菌双重培养过程中理想的宿主材料[11]。丛枝菌根真菌的离体纯培养从20世纪60年代兴起以来，从培养条件、遗传因素等方面进行了积极的探索，到目前为止，在人工培养条件下能够建立AM真菌与植物根器官或是植物转型根的共生体系，遗憾的是不能获得大量新一代的AM真菌孢子[12]，即不能达到用新生的次生孢子进行二次侵染的效果。AM真菌生长发育过程的相关理论知识相对较为缺乏，尤其是在其遗传方面知识的严重缺乏导致在实验研究过程中没有更多明确的思路，只能逐步探索。本文综述了AM真菌离体双重培养研究的发展、研究现状和未来的研究方向，希望能通过植物生理与分子生物学手段找出AM真菌生长发育过程中的关键物质，清晰透彻地阐明AM真菌遗传特性[13]，提高AM真菌次生孢子的产率及成熟率，最终实现AM真菌接种剂的规模化生产。

1　AM真菌双重培养的提出

AM真菌的扩繁方法主要有活体盆栽法、培养基培养法、玻璃珠分室培养法、AM真菌与植物根器官培养法、AM真菌与植物Ri-TDNA转型根离体单孢培养法等，活体盆栽法仍是目前获得AM真菌接种剂的常用且最为简单有效的方法，该方法具有获取方便的优点，但存在费时费力，培养周期长，繁殖体少等缺点[16]。培养基培养法较盆栽法复杂且只能获得极少量纯度较高的接种物。离体双重培养法是一种安全、高效的培养方法，该方法是在无菌的人工培养基上接种萌发的AM真菌孢子以及寄主材料，AM真菌菌丝侵入根系内部建立共生体，从根系获取营养来保证AM真菌的生长发育，完成生活史。

AM真菌是土壤中的一种活体寄主有益微生物，不能独立生存，适宜条件下AM真菌孢子能够萌发产生菌丝，在没有寄主存在的情况下，菌丝生长20天左右就停止生长[14]。究其原因：在脱离寄主后AM真菌不能独立完成新的细胞核DNA的合成，AM真菌孢子萌发菌丝需要侵入活体植物组织获取更多的蛋白质等营养物质保证核DNA的继续复制[15]。正是AM真菌专性活体寄主的特性限制了AM离体纯培养，只能在寄主存在的条件下完成生长发育的全过程，为此，科学家们做了大量AM真菌双重培养的相关研究。AM真菌与植物离体双重培养经历了两个主要阶段：AM真菌与植物离体根段共培养，AM真菌与植物转型根共培养。AM真菌与植物根段的培养存在植物根段在培养基上生长缓慢，需要添加外源生长物质等缺陷最终被否定；植物转型根则能在无激素培养基上快速生长，且存活时间久，对于需要长期观察AM真菌的生长发育过程来说，植物转型根则是最佳的宿主。

目前，已建立了AM真菌与宿主植物转型根的双重培养共生体系，但成熟孢子的数量及次生孢子的发育状况仍不能达到生产应用的要求。主要是未能找出AM真菌与宿主识别的关键信号物质，对影响AM真菌生长发育的内外因素认识模糊，对AM真菌生长发育后期次生孢子形成及成熟缺乏了解。值得高兴的是，利用AM真菌与植物转型根建立了双重培养共生体系，在进行共生培养过程中，可实时观察AM真菌的形态变化及生长发育的整个过程，同时也能获得少量纯净AM真菌成熟孢子，为获得纯净的AM真菌接种剂带来了希望，但用此法生产AM真菌接种剂还尚待时日。

2　AM真菌离体双重培养的现状

2.1AM真菌与植物根器官双重培养

AM真菌与植物离体根段双重培养是AM真菌离体培养的早期阶段，此方法在组织培养条件下将植物根段作为寄主与AM真菌孢子共培养，共生关系建立后AM真菌也能完成生活史，植物根段作为寄主材料存在植物离体根段在无激素的培养基上存活时间不长，而且根段生长速度较为缓慢，难以满足AM真菌完成整个生活史所需营养物质等弊端[16]。

1975年Mosse和Hepper首次将番茄和红三叶草的根段与Glomusmosseae建立成功共生关系，遗憾的是未能产生新生孢子；1984年，Miller-Widman 和Watrud在改良的培养基上建立了番茄离体根段与Gigaspora双重培养关系，且获得了次生球状巨孢囊霉孢子；Mossea等人利用Glomus真菌孢子在改良的怀特培养基上建立AM真菌与苜蓿根的共生体系[17]；Mosse and Hepper建立番茄及红三叶草与摩西球囊霉AM真菌的共生体系[18]；邵菊芳等人在改良的White培养基上建立了Gigasporamargarita孢子与白三叶草离体根系双重培养并获得次生孢子[19]；目前为止至少有27个AM真菌株系与植物根器官建立共生关系，统计结果如表1(转引 Nishi Mathur & Anil Vyas，2007)。

表1　AM真菌-植物离体根系列表

2.2AM真菌与植物离体转型根双重培养

AM真菌与植物离体根段共培养产生次生孢子的研究成功后，对AM真菌双重培养的研究越来越多，相继取得了一定的成果。利用植物根段作为宿主存在生长缓慢，需外源物质，存活时间短等缺陷，但AM真菌与植物根段能够建立共生关系为AM真菌与植物转型根建立双重培养体系奠定了基础。发根农杆菌侵染植物获得植物离体转型根，毛状根能够在无激素培养基快速生长，同时存活时间较植物根段长，研究者利用植物离体转型根作为AM真菌离体培养的寄主材料。1987年， Mugnier和Mosse首次成功建立了Convolvulussepium毛状根与Glomusmosseae的共生关系，遗憾的是未能产孢，之后利用毛状根与AM真菌孢子建立共生关系的报道逐渐增多。对于不同种属植物以及不同种属关系的AM真菌共生关系的研究结果不尽相同，这可能与植物和AM真菌本身的生理特性存在差异有关。以下是国内外近十年来AM真菌与植物转型根系双重培养结果见表2。

表2　AM真菌与植物转型根建立双重培养体系

3　存在的问题

利用AM真菌孢子萌发的菌丝与植物离体转型根进行共生培养是能快速获得大量真菌孢子的有效方法，也是最能直观体现AM真菌生长发育过程的最佳方法。目前利用离体双重培养技术仅能够获得少量纯净的次生孢子； AM真菌的生长发育过程中，可观察从孢子萌发产生菌丝，菌丝侵入根段到产生次生孢子的过程，但对整个过程却不能清晰具体地阐述。AM真菌的离体纯培养仍处于探索阶段，AM真菌与植物离体转型根建立的双重培养体系中的孢子产率远远不能满足AM真菌商品接种剂的要求，以下问题亟待完善。

培养方法：固体培养仍是主流趋势，固体培养是在固体培养基上接种AM真菌孢子与植物转型根建立共生关系。但有的AM真菌孢子的生长周期较长，培养过程中难以更换培养基，导致AM真菌在完成生活史前宿主植物已衰老，不能为孢子生长继续提供营养物质。

培养装置：目前的研究大多在培养皿内进行，在培养过程中，由于植物需要进行代谢过程，培养中在培养皿内容易出现水珠，容易导致污染且影响后续的镜检；

培养条件：营养情况、外界物理条件及遗传因素都会影响AM真菌的生长发育，目前的研究主要放在了营养状况及物理条件上，在遗传因素上的研究相对较少；

理论基础：AM真菌生理遗传方面的理论知识相对较为缺乏，仍处于探索阶段。

4　展望

AM真菌纯培养能否成功是生产AM 真菌接种剂应用于农业生产的前提，生理学与分子生物学相结合来开展AM真菌的离体纯培养研究是一种必然的趋势。AM真菌的离体双重培养主要是在固体培养基上接种AM真菌孢子与植物转型根，建立共生关系帮助AM真菌完成生活史。信号物质是建立共生关系的纽带，是后期培养过程中能否获得次生孢子的关键，当前的研究只能观察生长发育的整个过程，并不能清晰透彻的阐明AM真菌的生理遗传特性。AM真菌的双重培养处在一个封闭的空间里，培养结束后若利用GC-MC分析技术来检测容器里的物质成分及其变化，或许能找出促进共生关系建立的信号物质。AM真菌纯培养仍处于瓶颈阶段，分子生物学及基因工程技术将会是研究AM真菌遗传特性的有效途径，刘润进等人(2009)针对未来AM真菌的研究方向时提出：“必须加强AM真菌与植物共生关系基因表达的分子生物学研究，探索新的方法，完善并规范相应的菌根技术”。我们期待在分子生物学及高新科技的推动下，弄清AM真菌的生理遗传特性，通过设计一套合理的培养装置获得大量纯净的AM真菌孢子，为工业化生产AM真菌接种剂提供切实有效的方法。

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The research progress of AM fungi in vitro dual culture

RANHai-yan,JIANGLong*

(Collegeoflifescience,GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

Arbuscularmycorrhizae(AM) has play an important role in repairing the heavy metal pollution and producing the bacterial manure. The utilization of AM fungi was depended on the physiology and biochemistry or hereditary character of it. The vitro dual culture is a high-efficiency and convenient approach to study the biological function of AM. Using AM fungi spore and Ri-TDNA transformed roots to explore the growth and development of it that can present some theoretic conference about using AM fungi to product fungicide in the future. Some currently research progresses were summarized in here and related suggestions were proposed to the cultivation of AM in the future based on some issues which have encountered.

Arbuscularmycorrhizae; vitro dual culture; research progress

2016-03-10；

2016-04-05

贵州省社发攻关项目(黔科合SY字2011-3085)；教育部重点项目(2011-167)；贵阳市社发攻关计划项目(筑科合同 2011103-51)；贵州省烟草公司遵义分公司科技项目(遵烟技 2012-07号)。

江龙(1970-)，男，博士，教授，主要研究方向：植物生理学、菌根生物学；E-mail:jianglonggy@sina.com。

R283.6

A

1008-0457(2016)02-0062-06国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.012