猕猴桃病原真菌拮抗菌筛选

何应红， 钱一鑫， 康冀川*， 雷帮星

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025 )



·研究简报·

猕猴桃病原真菌拮抗菌筛选

何应红1,2， 钱一鑫2， 康冀川2*， 雷帮星2

(1.贵州大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 西南药用生物资源教育部工程研究中心，贵州 贵阳 550025 )

为控制猕猴桃真菌病害，本研究使用平板对峙法，从34株青蒿内生真菌中筛选出对5种常见猕猴桃病原真菌(Botryosphaeriadothidea、Collectotrichumsp.、Monilinialaxa、phomasp.、Alternariaalternata)具有广谱高效拮抗作用的菌株，并采用菌丝生长速率法检测了拮抗菌株发酵液及其发酵液粗提物对猕猴桃病原真菌的抑菌活性。结果表明：在平板对峙试验中，21号青蒿内生真菌具有较好的抑菌活性，对猕猴桃软腐病病原菌的抑制率高达81.16%，对其他几种猕猴桃病原真菌的抑制率也均在50%以上；21号菌株发酵液在浓度为20%时，对Botryoshaeriadothidea，Collectotrichumsp.，Alternariaalternate三种病害菌的抑制率分别达到了80.26%、79.12%、45.84%; 在1 mg/mL浓度下，21号菌株发酵液乙酸乙酯粗提物对Monilinialaxa、phomasp.的抑菌活性分别达到了100%、60.45%。研究表明21号菌株发酵液乙酸乙酯粗提物能有效抑制猕猴桃病害菌株，值得进一步研究。

猕猴桃; 青蒿; 病原真菌; 抑菌活性

猕猴桃(Actinidia chinensisPlanch.)具有丰富的营养价值和良好的药用价值。其果实中含有大量的糖、蛋白质、氨基酸等多种有机物和人体必需的多种矿物质及维生素，其维生素C的含量远远超过柑桔、苹果和梨，有“水果之王”、“Vc之王”之称[1]。目前贵州省猕猴桃栽培区有水城、修文、贵定、瓮安、湄潭、龙里、六枝、盘县、赫章、开阳、乌当等地，栽培品种有贵长、贵丰、贵密、贵露、红阳、海沃特、秦美[2-3]等，随着猕猴桃种植面积逐年扩大，猕猴桃病害造成的损失也随之加重。猕猴桃的主要病害有真菌性病害、细菌性病害、生理性病害，其中最常见、危害最严重的真菌病害有猕猴桃褐腐病(病原菌：Botryosphaeria dothidea)、猕猴桃炭疽病(病原菌：Collectotrichum sp.)、猕猴桃软腐病(病原菌：phoma sp.)、猕猴桃褐斑病(病原菌：Alternaria sp.)等。

目前控制猕猴桃真菌性的主要方法仍以化学杀菌剂为主，但由于化学杀菌剂容易出现抗药性和药物残留，不仅污染环境，还严重地威胁人体健康。随着人们对无公害食品的需求日益增加以及对环境保护的日益关注，生物防治已成为了人们控制植物病害的理想途径[4-5]。因此，筛选出抑菌活性高、抗菌谱广的拮抗菌株具有重要的意义。植物内生真菌是巨大的微生物资源，在工农业生产与医药应用潜力方面有重大意义。本研究从分离自青蒿(Artemisia carvifoliaBess.)的34株内生真菌中筛选对常见猕猴桃病害真菌具有拮抗作用的菌株，初步探讨其抑菌活性，以期开发出具有应用价值的天然药物。

1　材料与方法

1.1供试菌株

内生真菌34株，分离自贵州省六盘水不同地区青蒿的根、茎、叶和花。

猕猴桃病原真菌：猕猴桃炭疽病菌(Collectotrichumsp.)、猕猴桃褐腐病菌(Botryosphaeria dothidea)、猕猴桃褐腐病菌(Monilinia laxa)、猕猴桃软腐病菌(phomasp.)、猕猴桃褐斑病(Alternaria alternata)。分离于猕猴桃病害植株。

所有菌株均保存于贵州大学西南药用生物资源教育部工程研究中心药用真菌实验室。

1.2培养基

培养基为PDA培养基和沙氏培养基。

1.3拮抗菌株筛选

采用两点对峙培养法[6]，将活化好的内生真菌和病原真菌菌落，在无菌条件下用直径5mm的打孔器取其菌饼，接入直径为90mm的PDA平板一侧，在PDA平板另一侧接入病原真菌，同时以单独接种病原真菌的培养皿为空白对照，培养7d天后观察菌落的生长及抑菌情况，测量内生真菌与病原真菌菌落生长的相向直径，计算内生真菌对病原真菌的生长抑制率。病原真菌与内生真菌菌落相交后，观察记录内生真菌对病原真菌的包围、抑制及覆盖或占领其营养空间的过程，筛选出对病原真菌具有抑制作用的内生真菌。

菌丝生长抑制率(%) = (对照菌落直径 - 处理菌落直径)/(对照菌落直径-0.5mm) × 100%

1.4目标菌株次级代谢产物抑菌活性研究

1.4.1不同稀释浓度发酵液的抑菌活性

在无菌条件下，将活化好的21号青蒿内生菌落用9mm的打孔器沿菌落边缘打孔，接种至沙氏培养基(装液量为200/500mL)的三角瓶中，每瓶接种2个菌饼，于120r/min摇床培养7d，液体发酵结束后，发酵液经过0.22μm滤头过滤处理后，与培养基混匀倒平板，使平板内发酵液最终稀释浓度分别为0%、4%、8%、12%、16%、20%。采用菌丝生长速率法[7]测定发酵液对猕猴桃炭疽病菌、猕猴桃褐腐病菌、猕猴桃褐斑病菌的抗菌活性。

1.4.2目标菌株发酵液粗提物的制备

发酵液粗提物制备：上述液体发酵结束后，过滤分离菌丝体与发酵液，发酵液浓缩为原体积的1/10后，加入等体积的乙酸乙酯超声萃取3次，每次30min，取上层乙酸乙酯萃取液，合并后旋转蒸发浓缩成浸膏备用。余下水相再加入等体积正丁醇相同方法萃取三次，合并萃取液浓缩成浸膏备用。

1.4.3目标菌株发酵液粗提物的抑菌活性

分别称取0.2g的乙酸乙酯、正丁醇粗提物溶于3mL的丙酮溶液中，0.22μm滤头过滤除菌，与冷却至40-50℃左右的PDA培养基混匀后倒入6cm的平板，制成含药平板，使平板最终含药浓度为1mg/mL，以添加等量丙酮溶液培养基为空白对照。凝固后，将活化好的5mm病原真菌菌饼，分别置于含药培养基和对照培养基表面。实验设置3个重复。观察菌落的生长情况，并测量菌落直径，抑菌效果用抑菌率表示。

2　结果与分析

2.1拮抗菌株筛选

采用两点对峙培养法对病原真菌具有抑制作用的内生真菌进行筛选，结果见表1和图1。

表1　青蒿内生真菌对5种猕猴桃病原真菌的拮抗作用

注: 表中数据为内生真菌对病原真菌的抑制率， “—”表示抑制效果低于45%或者没有抑制效果。

(B6：猕猴桃炭疽病原真菌Collectotrichumsp.；B12：猕猴桃褐腐病病原真菌Botryosphaeriadothidea；HGHM: 猕猴桃软腐病病原真菌phomasp.；RSF: 猕猴桃褐斑病病原真菌Alternariaalternata；LHF: 猕猴桃褐腐病病原真菌Monilinialaxa，下同)

由表1可知，34株菌株中有20株内生真菌对至少一种猕猴桃病原真菌有大于45%的拮抗作用，有7株菌株对至少2种猕猴桃病原真菌有大于45%的拮抗作用，其中21号菌株抗菌谱最广，对猕猴桃炭疽病原真菌B6，猕猴桃褐腐病病原真菌B12、猕猴桃软腐病病原真菌HGHM、猕猴桃褐斑病病原真菌RSF、猕猴桃褐腐病病原真菌LHF均有抑菌活性，抑制率分别达到59.19%、66.67%、81.16%、57.10%、69.7 %。由图1可以看出，猕猴桃炭疽病B6在21号菌株的包围下不能继续生长，之间形成一条抑菌带，其他4种病原真菌与21号内生真菌接触后，生真菌菌落覆盖病原真菌菌落之上，抑制病原真菌的生长。因此，本实验选择21号菌株作为目标菌株，进一步检测其次级代谢产物对猕猴桃病害菌的抑菌作用。

图1　21号青蒿内生真菌对5种猕猴桃病害真菌的拮抗作用

注：A-E为只接猕猴桃病原真菌的对照组,分别为B6、B12、HGHM、RSF、LHF；a-e分别为21号菌株对以上几种猕猴桃病原真菌的拮抗效果，菌株编号同表1。

2.221号菌株不同稀释浓度发酵液的抑菌活性

对21号菌株进行发酵培养，将发酵液稀释成不同浓度对猕猴桃炭疽病菌、猕猴桃褐腐病菌、猕猴桃褐斑病菌的抗菌活性进行检测，结果见表2-4及图2。由表2-4中可以看出，随着发酵液浓度的增加，猕猴桃病原真菌的菌落逐渐变小，对猕猴桃病害病病原真菌的抑菌活性均呈上升趋势，发酵液浓度与抑菌率呈正相关，当发酵液浓度为20%时，对猕猴桃褐腐病、猕猴桃炭疽病、猕猴桃褐斑病三种病害菌的抑制率分别达到了80.26%、79.12%、45.84%；通过回归方程得出发酵液对以上三种病害菌的IC50值分别为10.33%、11.44%、19.48%。从图2可以看21号菌株发酵液对猕猴桃褐腐病病原真菌有很强的抑菌活性，菌丝在发酵滤液培养基上生长缓慢，菌落大小也随着发酵液浓度的增加而减小，菌丝明显稀薄。

表2　21号青蒿内生真菌发酵液对猕猴桃褐腐病(B12)病原真菌的拮抗活性

表3　21号青蒿内生真菌菌株发酵液对猕猴桃炭疽病菌(B6)的拮抗活性

表4　21号青蒿内生真菌菌株发酵液对猕猴桃褐斑病菌(RSF)的拮抗活性

图2　21号菌株发酵滤液对猕猴桃褐腐病病原真菌(B12)的抑菌作用(3d)

3.321号拮抗菌株发酵液粗提物的抑菌活性

21号菌株发酵液经乙酸乙酯和正丁醇萃取后粗提物(终浓度为1 mg/mL)溶于丙酮溶液中制成含药平板，并以等量丙酮溶液培养基为空白对照。将活化好的5 mm 病原真菌菌饼，分别置于含药培养基和对照培养基表面，其抑菌活性见图3。由图3可知， 21号内生真菌发酵液的乙酸乙酯、 正丁醇粗提物对4种猕猴桃病原菌都有不同程度的抑菌活性,乙酸乙酯粗提物对LHF、HGHM的抑制率分别达到100%、60.45%，具有较强的抑制作用。乙酸乙酯粗提物对病原真菌的抑制效果较好，其菌落的生长情况和抑菌效果见图4；而正丁醇粗提物除了对LHF有较好的抑制作用外，对其他病原真菌的抑制效果均不好。

图3　21号青蒿内生真菌发酵液粗提物对几种猕猴桃病原菌的抑菌率

图4　21号青蒿内生真菌发酵液的乙酸乙酯粗提物对4种猕猴桃病原真菌的抑菌情况

3　讨论

随着病原菌对杀菌剂耐药性、抗药性的出现和耐/抗药程度的不断增强和农药污染的日趋严重，人们渴望获得更多新型、安全、疗效更为显著的抗菌药物，而寻找新型抗菌药物的前提是找到新的药物筛选源[8]。生物防治成为目前植物病害防治研究的热点之一。本实验采用平板对峙法发现供试青蒿内生真菌菌株对于供试的5种猕猴桃主要病害病原菌均有不同的抑制作用，其中对猕猴桃炭疽病、猕猴桃褐腐病病原真菌具有抑菌活性的菌株较多，而对猕猴桃褐斑病和猕猴桃软腐病病原真菌有抑菌作用的菌株较少，同一内生真菌，对不同病原菌的抑制效果有明显的差异。而21号内生真菌对5种病原真菌均有较高的抑制作用，且抑制率均大于其他内生真菌的抑制率，可见21号菌株具有较强的抑菌活性，有进一步研究的价值。

实验研究表明拮抗菌对植物病害防治的作用机制主要表现为3种类型：(1) 抗生作用，指内生真菌分泌具有抗生作用的次级代谢产物使之与供试病原真菌菌落间产生抑菌带，内生真菌并不与供试病原真菌直接接触即可抑制其生长[9-10]；(2) 基质竞争作用，是由于内生真菌具有较快的菌丝生长速度或可快速大量产生孢子，菌落迅速扩展占领培养基质，减少和压缩了供试病原真菌可获得的营养和生存空间[10-11]；(3) 寄生作用，即内生真菌具有寄生供试病原真菌的能力，在与供试病原真菌接触后可继续生长，通过菌丝缠绕和寄生活动抑制供试病原真菌的生长，最后内生真菌菌落覆盖和代替病原真菌菌落于病原真菌菌落之上[11]。本实验平板对峙中的来自青蒿内生真菌的21号菌株对猕猴桃病病原真菌的拮抗作用主要表现为基质竞争作用和寄生作用，而发酵液及发酵液粗提物对植物病原菌均有抑制作用，说明该菌株可以产生具有抑菌活性的物质，表明21号菌株对猕猴桃病病原真菌的拮抗作用也表现为一定的抗生作用。此外有研究表明青蒿内生真菌具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化[12-15]等活性。我们将在后续研究中重点对青蒿内生真菌的21号菌株及其抗菌活性物质进行分离纯化与鉴定，深入开发青蒿内生真菌，以期服务于农业生产和医药卫生。

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ScreeningofAntagonisticFungiagainstPathogenicFungiofKiwifruitandDeterminationofitsAntimicrobialActivity

HE Ying-hong1,2, QIAN Yi-xin2, KANG Ji-chuan2*, LEI Bang-xing2

(1.College of life science, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China; 2.Engineering Research Centre of Southwest Bio-Pharmaceutical Resources,Ministry of Education, Guizhou University, Guiyang, Guizhou 550025, China )

Inthepresentstudy,dual-cultureinhibitionwasusedtoscreenantagonisticstrainsfrom34endophyticfungiofArtemisia carvifoliaagainstfivecommonpathogenicfungi(Botryosphaeria dothidea, Collectotrichumsp., Monilinia laxa, Phomasp., Alternaria alternata)ofActinidia chinensis.Also,growthratemethodwasemployedtodetecttheantagonisticeffectofthefermentationliquidandthecrudeextractsfromfermentedliquidagainstpathogenicfungi.No21endophyticfungiisolatedfromA.carvifoliademonstratedbetterantibacterialactivity.InhibitionratesofPhomasp. (A. chinensissoftrot)was81.16%,andthatofseveralothertestedpathogenicfungireachedhigherthan50%.Inhibitionratesof20%fermentationliquidagainstB. dothidea, Collectotrichumsp.,andA. alternatewere80.26%, 79.12%, 45.84%,respectively.TheethylcrudeextractsofNo21strainfermentationliquid(1mg/mL)gave100%and60.45%inhibitionratesagainstM. laxaandPhomasp.,respectively.Therefore,theethylcrudeextractsofNo21fermentationliquidmighteffectivelyinhibitthepathogenicfungiofA. chinensis,andwaspromisingfordeservingfurtherexploitation.

Actinidia chinensis; Artemisia carvifolia;Pathogenicfungi;Antimicrobialactivity

2015-12-21；

2016-03-10

贵州省中药现代化科技产业研究开发专项项目(黔科合中药字[2012]5008号)；贵州省科技创新人才团队建设项目(黔科合人才团队[2012]4007号)。

康冀川，男，教授，博士生导师，主要研究方向：分子生物学和真菌学；E-mail: bcec.jckang@gzu.edu.cn。

Q945.8

A

1008-0457(2016)02-0068-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.013