拟南芥PGK基因家族功能的初步分析

黄小贞，赵懿琛

(1.贵州大学 农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025 )

·研究报告·

拟南芥PGK基因家族功能的初步分析

黄小贞1，赵懿琛2

(1.贵州大学 农业生物工程研究院，山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 药学院，贵州 贵阳 550025 )

磷酸甘油酸激酶(Phosphoglycerate kinase)是一类进化上非常保守的蛋白家族，因而利用模式植物拟南芥研究PGK家族基因功能具有普遍意义。拟南芥基因组中含有三个PGK基因家族成员(PGK1，PGK2和PGK3)，但是对于它们的基因表达模式和蛋白定位的研究还不是很清楚。本文利用实时荧光定量PCR技术检测了PGK基因家族的表达模式，结果表明三个PGK基因在拟南芥的各个组织器官和发育阶段中都有表达。利用拟南芥原生质体瞬时转化系统对三个PGK蛋白进行亚细胞定位，结果显示PGK1和PGK3定位于细胞基质，而PGK2定位于叶绿体。另外，我们分离得到了PGK2基因的T-DNA插入敲除突变体pgk2。pgk2在正常条件下表现出叶片黄化，PR1基因上调表达和H2O2过量积累等类似于超敏反应的细胞死亡表型。进一步的遗传分析表明pgk2的细胞死亡表型和T-DNA插入位点紧密连锁，暗示着pgk2的细胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的，因此PGK2可能在调控植物细胞程序化死亡过程中有重要作用。以上研究结果对于进一步探讨PGK基因家族的功能具有重要的参考价值。

拟南芥；PGK基因家族；蛋白定位；细胞死亡

糖酵解是生命有机体能量代谢最重要的途径之一，而磷酸甘油酸激酶(PGK，EC2.7.2.3)则在这个生理过程中有重要作用。在糖酵解第二个阶段的第二步中，PGK作为关键酶催化1，3-二磷酸甘油酸(1，3-BPG)生成对3-磷酸甘油酸(3-PG)的可逆反应：

对于大多数生物来说是非常必要的，涉及到需氧菌的ATP产生、厌氧菌的发酵以及植物中碳的固定等[1]。在原核细胞中，PGK只有一种存在形式；而在大多数真核生物体内，则含有2～3种PGK同工酶。这些同工酶不仅在生物体内分布不同，还具有独特的生物学功能。PGK的编码序列在整个进化过程中都高度保守，该酶功能基因的突变会引起生物体各种代谢紊乱和异常。在微生物和动物中，关于PGK突变的报道相对比较多[2]。大量研究表明，人类的PGK基因在神经功能的紊乱、横纹肌溶解以及肿瘤的生长等方面有重要作用[3]；哺乳动物中，PGK还具有二硫化物还原酶的催化活性[4]。在植物中，关于PGK蛋白晶体结构以及酶的核心催化位点的报道研究较多[5，6]，而对PGK的基因表达和蛋白定位等生物学功能方面研究的比较少。近年来，虽然也有一些证据表明植物中的PGK可能涉及到生物胁迫和非生物胁迫的抗性反应[7-9]，但总体而言，植物中PGK的功能仍然很不清楚。本文以模式植物拟南芥为研究对象，系统分析了拟南芥中三个PGK成员：PGK1、PGK2和PGK3的基因时空表达模式、蛋白定位以及可能的基因功能。

1 材料与方法

1.1 材料

实验所用材料是拟南芥(Arabidopsisthalinan)，其中野生型Columbia(Col-0)生态型和突变体Salk_071724均购买自美国俄亥俄州立大学的拟南芥生物资源中心(Arabidopsis Biological Resource Center， ABRC)。植株生长在光周期为16 h光照/8 h黑暗，温度22℃左右的温室中。

1.2 基因表达分析

用TRIZOL(Invitrogen)试剂提取各个植物组织的总RNA。之后用RNase free DNase(Takara)在37℃处理20 min，充分降解基因组DNA。取2 μg RNA，利用逆转录酶(Promega)和Oligo dT21合成cDNA链。设计基因特异的荧光定量PCR引物(PGK1-F：5′-ATGGCTTCCGCTGCCGCAAG-3′和PGK1-R： 5′-GAAGCTCGGAGAGCCTAGGGA-3′；PGK2-F：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和PGK2-R： 5′-AGTGACTGGCGTTGCTTCATC-3′；PGK3-F：5′-ACACAGTTGACATCCTCCTGC-3′和PGK3-R： 5′-TAGAGATGTGGCTCATCTTGTC-3′)；采用参考文献[10]描述的方法进行荧光定量PCR，检测三个基因的表达模式，实验重复三次，所得数据利用t检验进行统计分析[11]。

1.3 蛋白定位载体的构建

用两步克隆法构建PGK1、PGK2和PGK3三个蛋白的定位载体。第一步：设计扩增三个基因全长编码区域(Coding DNA Sequence：CDS)的引物(PGK1-F(EcoRI)：5′-GAATTCCACATGGCTTCCGCTGC-3′和PGK1-R(Stu1)：5′-AGGCCTAACAGTGACTGGGATTG-3′； PGK2-F(BamHI)：5′-GGATCCCTCACTTTCACTCTCACTA-3′和 PGK2-R(StuI)：5′-AGGCCTAACAGTGACTGGCGTTGCTTCA-3′； PGK3-F：5′-ATGGCGACGAAGAGAAGCGTT-3′和PGK3-R(SmaI)： 5′-CCCGGGAGCTTCGTCGAGAGCGAG-3′)；以Col-0野生型的cDNA为模板，用高保真酶(Takara)扩增出三个基因的CDS，连接T载体(Takara)送去测序。第二步，测序正确后从T载体上切下目的片段连接到C-端接有荧光蛋白(Green Fluorescent Protein： GFP)的定位载体[12]。

1.4pgk2纯合突变体的鉴定

设计两对鉴定引物(PGK2-P1：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和PGK2-P2：5′- GCAGTTGATTGATGTTTTGCTC-3′； 和PGK2-P1：5′-CGAATCGCTTCTTGAGAAATG-3′和LB： 5′-GCTGTTGCCCGTCTCACTGGTG-3′)利用PCR检测出相应的纯合体。其中，P1/P2引物是根据T-DNA插入位置设计的基因特异的序列，LB是Salk突变体特异的插入序列。判断突变体为纯合体需要同时满足：1.第一对引物PGK2-P1/ PGK2-P2在野生型(对照)中能得到大小符合PGK2-P1/LB特异基因序列长度的 PCR片段，而在纯合插入突变体中这对引物不能得到PCR产物；2.第二对引物PGK2-P1/LB在野生型(对照)中不能得到PCR产物，而在纯合插入突变体中这对引物能得到大小符合T-DNA插入位置与基因序列中P1或P2距离长度匹配的片段。

1.5 细胞死亡检测

用伊文斯兰(Evans Blue)染色剂，检测死亡细胞[13]。首先将所要检测的叶片剪下，浸泡在水溶的0.1% 伊文斯兰溶液中，利用真空泵抽真空10 min，然后保持真空状态30分钟，重复该过程一次。之后，取出室温放置4～6 h，将染色后的叶片用PBS缓冲液(0.2 M NaCl， 2.6 mM KCl， 10 mM KH2PO4， 1 mM K2HPO4， pH 7.4， 0.05% 吐温20)清洗叶片数次，叶片上的蓝色斑点即代表死亡的细胞。

1.6 过氧化氢检测

用二氨基联苯胺(3，3-diaminobenzidine，DAB)检测过氧化氢积累。首先将要检测的叶片剪下，浸泡在含有1 mg/mLDAB(pH 3.8)的溶液中过夜；之后用清水漂洗数次，然后再把叶片放进体积比为1∶1∶3的乙酸∶甘油∶乙醇的混合液中，煮沸5～10 min进行脱色处理。最后观察叶片，棕色的部分即代表有过氧化氢积累。

1.7 原生质体制备和蛋白定位

制备完整原生质体的试剂和方法主要参考文献[14]。首先，将在短日照条件下生长良好的野生型叶片，用锋利的小刀切成1 cm 宽的叶条，然后将叶条浸泡在酶解缓冲液中(500 mM mannitol， 10 mM CaCl2， 5 mM MES/KOH (pH 5.5)， 3% cellulase， and 0.75% Macerozym)，并置于摇床中轻摇、酶解4～6 h；酶解过程中通过显微镜检查酶解效果，以能够观察到较多原生质体为最佳酶解时间。酶解完成后，利用60 mm 的尼龙膜(Saryu Textiles， Mumbai， India)收集过滤去掉杂质；并用悬浮缓冲液清洗原生质体(0.65 M sorbitol， 1 mM CaCl2， 0.5 mM MgCl2and 10 mM N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid(HEPES)-KOH， pH 7.0)，最后低速离心收集原生质体。将带有GFP标签的表达载体建好之后，用高纯质粒提取试剂盒提取相应质粒，利用PEG介导的转化方法将表达载体转入原生质体中，温室培养12 h后用激光共聚焦显微镜(LSM510， Carl Zeiss， Oberkochen， Germany)观察蛋白定位情况。扫描程序采用红绿光双通道扫描模式，用488 nm的波长激发GFP绿色荧光，用543 nm波长激发叶绿体自发红光。实验中，单独转化带有GFP的空载体作为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 拟南芥中PGK基因家族的氨基酸序列同源性比较

早期研究结果表明，拟南芥含有三个PGK的同工酶[15]，分别是PGK1(AT3G12780)、PGK2(AT1G56190)和 PGK3(AT1G79550)。根据公布的拟南芥Col野生型基因组序列(http：//www.arabidopsis.org/)，PGK1编码481个氨基酸，PGK2编码478个氨基酸，PGK3编码401个氨基酸。通过DNAMAN软件比对和网站BLAST (http：//www.arabidopsis.org/cgi-bin/wublast/wublast)发现，这三个基因的氨基酸序列相似度较高 (图1)。其中，PGK1和PGK2的同源性达到87%，PGK1、PGK2与PGK3的同源性都为76%。

2.2 拟南芥PGK基因的组织表达模式检测

为了更好的了解PGK1、PGK2和PGK3基因的表达特点，我们检测了PGK1、PGK2和PGK3在野生型的各个组织器官中的表达情况。如图2所示，PGK三个基因的组织表达特异性各有不同，但整体在植株的根、幼苗、成熟苗、茎、开放的花器官和果荚都有表达。PGK1和PGK3在幼苗中的表达量比在成熟苗中的表达量高，并且它们在花器官中的表达量也比较高，而在根和茎中的表达量则相对比较低。PGK2基因则主要是在成熟苗中表达比较强，在根、茎、花和果荚等器官中表达相对较弱。

2.3 拟南芥PGK家族的蛋白定位分析

为了更好的了解PGK1、PGK2和PGK3蛋白的生物学功能和定位，我们构建了它们的全长CDS连接荧光蛋白GFP的定位载体，利用原生质体瞬时表达系统，通过激光共聚焦显微镜进行定位观察。结果如图3所示：对照组单独转化带有GFP的空载体显示荧光信号在整个原生质体细胞内，包括细胞膜、细胞质和细胞核中都有表达；而PGK1和PGK3这两个蛋白则主要在细胞基质中表达；PGK2的荧光信号很明显共定位于自发红光的叶绿体中，两种信号完全重叠，显示出黄色，这个结果充分说明PGK2共定位于叶绿体中。

图1 拟南芥中PGK三个同源基因的氨基酸序列比较Fig. 1 Comparison of amino acid sequences of three PGK homologous genes in Arabidopsis thaliana

图2 拟南芥中三个PGK的基因表达模式比较

Fig.2 Gene expression pattern of threePGKsinArabidopsisas identified by quantitative real-time PCR

图3 拟南芥原生质体中三个PGK基因的蛋白定位

Fig.3 Localization of the PGK1、PGK2 and PGK3 proteins inArabidopsisprotoplast

2.4PGK2敲除突变体pgk2的表型和遗传分析

为了更好的研究PGK基因家族功能，我们从ABRC订购了PGK1、PGK2和PGK3的T-DNA插入突变体，鉴定出纯合体后分别命名为pgk1、pgk2和pgk3。其中，pgk1和pgk3的纯合体，在正常生长条件下没有表现出任何表型。有趣的是，我们发现pgk2在正常生长条件下表现叶片黄化萎蔫的表型(图4.a)。RT-PCR检测发现，在pgk2中，PGK2基因基本不表达(图4.b)，因此pgk2 确实是PGK2的功能缺失突变体。进一步用伊文斯兰和DAB检测发现该突变体中积累了大量的死细胞(图4.c)和过氧化氢(图4.d)，荧光定量PCR检测发现病程相关蛋白(Pathogen Proteins， PRs)PR1在pgk2中被显著上调了(图4.e)，因此pgk2表现出植物程序化细胞死亡(Programmed cell death， PCD)的表型。PCD信号的形成通常伴随着一系列级联反应的发生，包括细胞死亡，活性氧、水杨酸的大量积累和病程相关蛋白的诱导表达。pgk2具有类似PCD的表型，并且这种表型随着植株的生长而增强，无法完成开花结果最终死亡。

图4 pgk2的细胞死亡表型Fig.4 The cell death phenotype of pgk2 plants

为了进一步分析该突变体的遗传特性，我们检测了pgk2与野生型回交F1代和F2代。所有的F1代(N= 20)表现出野生型正常的表型，表明pgk2的细胞死亡表型是隐性基因控制的。360 株F2代中，突变型和野生型分别为 91株和269株，经分离х2检测比率符合1∶3 (х2= 0.061，p= 0.05)，表明pgk2的细胞死亡表型是单基因控制的。进一步分析显示，所有细胞死亡的pgk2突变体都具有卡那链霉素抗性(Kan-R)，并且都是T-DNA插入纯合突变体(图4.f)。从F2中随机选择具有Kan-R的细胞死亡突变体200株，检测发现细胞死亡表型植株和野生型植株分别为 64株和136株，经х2检测两种表型符合1∶2(х2= 0.202，p<0.05)。因此，遗传分析结果说明pgk2细胞死亡的表型是和T-DNA插入位点紧密连锁的，该结果暗示着pgk2的细胞死亡表型是由于PGK2的基因缺失造成的。

3 结论与讨论

PGK广泛存在于原生动物、植物、线虫以及哺乳动物中，是一类进化上非常保守的蛋白家族，它们在细胞代谢过程中扮演着重要的角色[16-19]。拟南芥核基因组编码三个PGK基因，Laurence Ouibrahim等通过生物信息学方法，预测这三个基因在各个组织器官中广泛表达[8]。本研究的荧光定量结果表明，拟南芥PGK三个基因确实在植株的根、幼苗、成熟苗、茎、开放的花器官和果荚中都有表达。其中PGK1和PGK3表达模式较为相似，暗示着它们可能在相同的组织部位和发育阶段中起作用。但是这两个蛋白同源关系相对较远，可能在功能上进行相互补充。

蛋白的亚细胞定位对于基因生物学功能的执行非常重要，有研究表明植物体内至少存在着两种定位类型的PGK同工酶[20，21]，分别是细胞质中的PGK(cPGK)和质体中的PGK(pPGK)[22]。虽然它们在结构上非常相似，但各自承担的功能不同。一般认为胞质中的cPGK主要参与糖酵解过程，而质体中的pPGK则涉及到卡尔文循环中光合碳还原过程[8，22]。目前，关于拟南芥中PGK蛋白在原生质体中的定位研究还没有任何报道。本研究首次利用原生质体瞬时转化的方法确定了这三个蛋白的定位，发现在拟南芥中确实存在两种定位类型的PGK蛋白，与前人报道相符。研究结果表明PGK2定位于叶绿体中，而PGK1和PGK3则主要在细胞基质中表达。PGK1和PGK2氨基酸序列相似程度较高，暗示它们可能起源于相同类型的PGK同工酶；但它们的组织表达模式和蛋白定位的不同，则表明这两个蛋白在植物的不同发育阶段和细胞的不同区域中起作用。糖酵解的过程主要是在细胞质中进行，Atsushi Ikemoto认为细胞质中的PGK负责糖酵解中至关重要的底物水平磷酸化[23]，PGK1和PGK3都定位于细胞质中，说明这两个基因主要功能可能是作为糖酵解的关键酶。因为PGK1和PGK3的基因表达模式相近，定位相同，说明它们可能存在着功能上的冗余，这两个基因的敲除突变体pgk1和pgk3都没有表现出明显发育上的缺陷，也间接证实了这一点。

PGK2作为拟南芥中唯一定位于叶绿体的磷酸甘油酸激酶，它的功能研究得还不是很清楚。Laurence Ouibrahim发现PGK2的氨基酸发生突变，能改变植株对西瓜花叶病毒的抗性[8]。Rohit Joshi认为在烟草中异位表达水稻的OsPGK2能改变转基因烟草耐受盐胁迫的能力[7]。本研究从拟南芥T-DNA突变体库中筛选到PGK2的基因敲除突变体pgk2。利用PCR和遗传分析，我们确认了PGK2 基因中的T-DNA插入和pgk2 突变体中的PCD表型紧密连锁，暗示着pgk2的PCD表型可能是由于PGK2的基因缺失造成的。PCD是生物体为调节自身动态平衡，主动清除有害或者多余细胞的一种受遗传调控的生理过程[24]。植物中的PCD过程在某些方面和动物的细胞凋亡存在类似之处，都会出现细胞核迅速破裂、染色质凝聚、DNA 片段化等特征[25]。大量的研究结果表明，光照、ROS、激素、代谢酶，特别是叶绿体相关的代谢酶都参与了植物的PCD过程[26-29]。本研究的结果发现叶绿体蛋白PGK2作为细胞代谢过程中的关键酶可能也参与了植物PCD的形成过程。以上研究结果对于进一步探讨拟南芥以及其它生物体中的PGK家族基因功能具有重要的理论指导意义和参考价值。

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Functional analysis ofPGKgene family in Arabidopsis

HUANGXiao-zhen1，ZHAOYi-chen2

(1.TheKeyLaboratoryofPlantResourcesConservationandGermplasmInnovationinMountainousRegion(MinistryofEducation)，InstituteofAgro-BioengineeringandCollegeofLifeSciences，Guiyang，Guizhou550025，China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China)

Phosphoglycerate kinase (PGK) belongs to an evolutionarily conserved protein family. Therefore， investigation of the functions of PGK gene family using model plant Arabidopsis thaliana has universal significance. The genome of Arabidopsis thaliana contains three members of PGK gene (PGK1，PGK2 and PGK3)， but the biological roles of these members are still unclear. In the present study， we examined the expression profiles ofPGKgene family using real-time fluorescence quantitative PCR. Our findings suggested that all three members of PGK gene are able to express in different tissues in different development stages and its expression was tissue-specific and developmentally controlled. Meanwhile， the subcellular localizations of PGK proteins were analysed using the transient transformation of Arabidopsis protoplast. The results demonstrated that the PGK1 and PGK3 proteins were localized in the cytoplasm， while PGK2 localized in the chloroplast. Additionally we also isolated a putative PGK2 gene knockout mutant:pgk2. Interestingly，pgk2 exhibited hypersensitive response-like (HR) phenotypes under normal conditions. Further genetic analysis reveals that the HR-like phenotype is tightly linked to the T-DNA insertion at a single locus， which suggests PGK2’s involvement in the regulation of plant programmed cell death. These data will be helpful in gaining a deeper understanding of the functions ofPGKgene family in plant.

Arabidopsisthaliana;PGKgene family; protein localization; cell death

2016-09-18；

2016-11-07

贵州省科学技术基金项目(黔科合J字[2015]2053号)；贵州大学引进人才科研项目合同(贵大人基合字[2014]63号)。

Q94

A

1008-0457(2017)01-0012-06 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.002

*通讯作者：黄小贞(1982-)，女，博士，讲师，从事植物生长发育与抗逆分子机制研究；E-mail：xzhuang@gzu.edu.cn。