西南区应用的7个玉米骨干系与美国自交系的SSR标记分析

赵小敏， 柏光晓*， 任 洪，杨雯竹

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省旱粮研究所，贵州 贵阳 550006；3.贵州省农作物种子总站，贵州 贵阳 5500012)

西南区应用的7个玉米骨干系与美国自交系的SSR标记分析

赵小敏1， 柏光晓1*， 任 洪2，杨雯竹3

(1.贵州大学 农学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州省旱粮研究所，贵州 贵阳 550006；3.贵州省农作物种子总站，贵州 贵阳 5500012)

利用 41对玉米 SSR 引物对 49份美国玉米自交系和7份西南区骨干自交系进行遗传多样性分析，共检测出169个等位基因有变异位点，每对引物检测到等位基因2～10个，平均4.12个；每对SSR引物的多态信息量(PIC值)变化范围为 0.299 ～0.885，平均值为 0.652。按UPGMA方法对供试自交系进行聚类，以遗传距离0.572为基准，可将供试材料划分为七类。56份自交系的SSR标记聚类分析表明，78%的美国自交系与西南区常用自交系之间也存在着较大的遗传差异，被单独聚为四类，而22%美国玉米自交系与西南区玉米自交系具有一定的同源性，被聚在第Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ类。通过美国玉米种质和西南区应用种质的SSR标记分析，为加强西南区玉米育种材料的改良、创新和利用，以及品种选育提供参考。

西南区；美国玉米自交系；SSR 分子标记；聚类分析；改良利用

种质资源狭窄是当前我国玉米育种和生产的突出矛盾[1]。在过去五十多年里，我国玉米生产取得了很大进步，正逐步追赶世界先进水平，但与美国相比还有很大差距[2]。而西南区平均单产更是低于全国平均水平， 西南地区玉米育种缺乏优质、抗逆、高配合力和适应性广的种质，已成为影响玉米商业育种进一步发展的“瓶颈”[3-6]。引进美国优异资源并加以改良、创新利用是解决种质资源狭窄的有效途径，利用和导入外来种质，可以丰富玉米种质， 扩大遗传基础， 改进玉米的农艺性状，尤其是机械化应用的性状，拓宽适应性。

近年来，随着玉米SSR引物的大量开发和应用，SSR标记技术已经被广泛用于玉米种质遗传多样性的研究。Zheng等[7]利用SSR标记对中国和美国各18个自交系进行了遗传多样性分析以及杂种优势类群划分，发现25.5%和19.8%的等位基因在中国和美国的自交系中是特异的，并认为两国的玉米自交系中存在着丰富的遗传多样性。遗传多样性分析为玉米种质资源保护和利用提供可靠的依据[8]，有利于育种材料的改良、创新和利用。

2012年国家玉米产业体系从美国农业部USDA-ARS引进160份解密的商业自交系，分发到全国各区域的综合试验点进行鉴定并对外开放考察。2014年，贵州大学玉米研究所从国家产业体系西南区的贵阳试验点和遵义试验点的田间开放材料地里，根据田间表现，选出表现较好的49份美国自交系。本研究利用SSR分子标记，对 49份美国玉米自交系和7份西南区应用的骨干自交系进行遗传多样性分析，对这些美国玉米自交系和西南区常用自交系进行比较分析，以期为加强西南区玉米育种材料的改良、创新和利用，以及品种选育提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

49份美国玉米自交系和西南区7个骨干自交系，各材料的名称及系谱来源(见表1)。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取与检测 参考文献[9]的 CTAB 法并加以改进。各取供试材料 20 粒种子于 25 ℃的恒温培养箱中发苗至三叶一心期，每份自交系取 10 株同一心叶等量嫩叶混合，提取纯化各个自交系的基因组 DNA。用紫外分光光度计(EV300，VSA)检测DNA浓度和质量。用超纯水将DNA样品浓度稀释至50 ng/μL，-20℃保存备用。

表1 56份自交系及其系谱来源Tab.1 The name and pedigree of 56 corn inbred lines

续表1

注：其中1-48和50为美国玉米自交系；49、51、52、53、54、55、56为西南区骨干自交系。

1.2.2 SSR引物的选择 从180对SSR核心引物中，经初步筛选，确定多态性好且稳定的41对SSR核心引物。序列源自http：//www.Maizegdb.org，均匀覆盖玉米全基因组，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。

1.2.3 SSR 分析 扩增反应在 DNA Engine 上进行。PCR 反应总体系为 10 μL组分配制(见表2)。反应液上加盖一层石蜡油，以防止反应过程中水分蒸发，热循环反应程序(见表3)。

反应产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行检测。120 V恒压电泳2 h后，进行固定，银染，显影和照相。

表2 PCR反应体系Tab.2 PCR system

表3 PCR扩增反应程序Tab.3 PCR thermo-cycle program

1.2.4 数据统计分析 SSR扩增产物以 0，1，9 统计建立数据库，在相同的迁移位置上( 相同的分子量片段) 有带记为 1，无带记为 0，缺失记为 9。按 Nei 和Li[10]的方法计算自交系间的遗传相似系数( GS) = 2Nij/ ( Ni+ Nj) 和遗传距离( GD) = 1-GS。其中，Ni为 i 品种出现的谱带数，Nj为 j 品种出现的谱带数，按照 UPGMA 方法对各材料进行聚类作图，数据处理由 NTSYS-P2.10e 软件完成。

2 结果与分析

2.1 SSR分子标记遗传分析

从均匀分别于染色体组的180对SSR引物中筛选出扩增条带清晰稳定的41对引物(表4)。多数引物在供试自交系中扩增出两条以上的条带，如引物umc2293可检测到10个等位基因变异，这可能与基因组内存在2个以上与引物结合的靶位点等因素有关。41对引物在56份供试材料上检测出169个等位基因变异，每对引物检测出2～ 10个等位基因，平均4.12个，片段大小介于100～ 600bp。41对引物位点的平均多态性信息量为0.661，变化范围为0.299(umc2192)～0.885(umc2292)。图1为引物umc2409在56个自交系中的扩增结果。

图1 引物umc2409在56个玉米自交系中的扩增结果Fig.1 DNA fingerprints of 56 maize inbred lines using SSR primer umc2409

注：49、51、52、53、54、55、56号为西南区常用骨干自交系

表4 41对SSR引物在56份玉米自交系中 检测到的等位基因数目及PIC值Tab.4 Alleles number and PIC of 56 maize inbred lines by 41 pairs of SSR

续表4

编号引物图谱位置等位基因数信息量24umc20366.0120.42325dupssr136.0840.73126umc17417.0140.72627umc22107.0420.47728umc17287.0670.85429umc10338.0380.86430umc18678.0430.49831bnlg15838.0540.71832umc14948.0650.77833umc18588.0730.66134bnlg14519.0170.84535umc21759.0260.80036umc11969.0330.66737bnlg12039.0550.78438phi32315210.0530.62839bnlg39110.0140.71340bnlg117910.0530.56141umc139810.0730.617

2.2 SSR标记聚类分析

按UPGMA方法对供试自交系进行聚类，以遗传距离0.572为基准，可较为清楚地按材料的特性将其划分为七类(图2)。Ⅰ类群包括PHK76、P200、1164、PH6WC、郑58、WIL900、PHV07、PHW30、PHP55，为Reid种群，以西南区应用比较广泛的3个自交系(郑58、P200和1164)为代表。49个美国自交系中有12%聚在这一类群，与3个代表自交系间的相似系数变幅为0.5385～0.6746，平均为0.6017， 有较大的同源性；

第Ⅱ类群为Iodent

图2 56份玉米自交系的UPGMA聚类图Fig.2 56 UPGMA cluster map of Maize Inbred Lines

群，占37%，包括PHK42、PHJ89、LIBC4、S01250、J8606、BCC03、PHM10、PHW65、PHM49、PHP02、PHH93、PHJ90、PHJ31、PHM57、ICI740、LH213、LH212Ht、PHR58。Iodent群是先锋公司独有的重要杂种优势类群，代表自交系为 PH207，它是当代美国最重要自交系的 7 个祖先种之一。第Ⅲ类群包括：PHV63、WIL500、PB80、912、PHW17、PHT55、2369、2FACC、LH195、PHR47、PHW52、FBLA、LH209、F118、ICI893、PHR55、PHW51，占35%，属于衣阿华坚秆综合种(BSSS)。衣阿华坚秆综合种(BSSS)是衣阿华州立大学的George Sprague博士于 1932～1934 年人工合成的综合群体，该综合群体由 16 个自交系的互交群体组成，在第二轮选择中又加入了 4 个自交系亲本成分，总共含有 20 个自交系亲本的血缘[11]。这些自交系血缘中多含有典型BSSS种B73的血缘，或者含有B73的衍生系，如含有LH195。B73是美国当代商业育种中重要玉米自交系，配合力高，应用十分广泛。第Ⅳ类群包括：6M502、MBST、78551S、CS405、S909、S273和Y8201，其中S909和S273为苏湾热带血缘，Y8201为巴西热带血缘，这三个自交系为西南区常用热带种质，因此，这一类群属热带血缘。在这一类群中美国自交系与西南区常用热带种质间相似系数为0.5503～0.6450，平均0.5896。第Ⅴ群只有HB8299。Ⅵ类群为墨白热带血缘，包括MBUB和C171，两者相似系数为0.645，同源性高；其中C171为墨西哥热带血缘。Ⅶ类群为LH65。其中HB8299和LH65分别单独为一个类群，不能和其他自交系划分到同一类群，说明这两份材料与其他材料之间遗传差异较大(见表5)。

3 结论与讨论

3.1 结论

SSR分子标记能够从本质上揭示玉米种质的遗传规律[12]。本研究利用 41对 SSR分子标记对 56份自交系进行遗传多样性分析，每对引物检测出 2 ～ 10个等位基因变异，平均为 4.12个； 每个位点的 PIC 变幅为 0.299 ～0.885，平值为 0.652。表明利用 SSR能够较灵敏地检测出供试自交系间的遗传差异，结果高于杨留启等[13](利用26 对SSR引物分析 13 个 o2 玉米自交系，平均等位基因变异 3.54 个，平均 PIC为 0.59) 和崔庆新等[14](利用 120 对SSR引物分析 10 个高油玉米自交系及其与 21 个属于不同优势类群普通玉米自交系间

表5 56 个玉米自交系 UPGMA 聚类结果Tab.5 Cluster results using UPGMA based on 41 SSRs among 56 maize inbred lines

的遗传关系，平均等位基因变异3.56个，平均 PIC为 0.56) 的分析结果；低于韩萌[15](等利用23对SSR 引物分析101份贵州省玉米地方种质，平均等位基因变异11个，平均PIC为0.875) 的分析结果，原因与所选材料不同及引物的数量、种类有关。从实验结果来看，56份供试自交系被分别分到了七个类群中，自交系SSR的聚类划分与实际系谱基本一致，但有个别自交系存在一些差距，如：WIL500与WIL900属于一个来源，却被聚成了不同类群。这可能与系谱主观性有关。由聚类结果可以看出，美国自交系间相似系数的范围为0.369～0.9231，说明美国玉米种质存在较为广泛的遗传基础。其中78%美国自交系与西南区自交系的遗传基础较远，形成单独的四个类群，因此，美国种质与西南区种质之间也存在着较大的遗传差异。另一方面美国自交系中有22%与西南区应用广泛的Reid和热带种具有一定的同源性，被聚在第Ⅰ、Ⅳ和Ⅵ类。

3.2 讨论

瑞德×苏湾杂种优势利用模式是目前西南玉米育种区应用广泛、成效显著的一个优势模式，已成功选育一大批优良的玉米杂交种在生产上推广应用[16]。热带、亚热带种质具有丰富的遗传变异性，子粒品质好、根系发达、持绿期长、抗多种病害，但也具有对光周期敏感、生育期较长、收获时子粒含水量高等不良特性[17-20]。美国玉米种质具有茎秆坚韧、穗位低、耐密植、抗倒伏、籽粒含水量低和适应机械化等特点，可以将其与热带种质聚在同一类群，同源性较高的美国自交系作为非轮回亲本对西南区常用的热带血缘系进行回交改良。也可以根据性状特征和育种目标组成不同的群体，进行多次遗传重组后作为父本群选系材料。同理，可用同种方法对西南区中Reid种群的代表自交系进行改良或遗传重组，作为母本群选系材料。

随着经济的发展，劳动成本日益提高，土地流转制度的改变和机械化应用于生产，西南区育种目标要由过去的高秆大穗改变为早熟耐密、抗逆性强、脱水快，收获时子粒含水量低、便于机械化操作等特点。因此，引进美国种质并加以改良和利用显得尤为重要，在考虑西南区的生态条件和地区的特殊性后，除了传统的瑞德×苏湾杂种优势利用模式以外，我们还可以采用衣阿华坚秆综合种(BSSS)×热带种质，或者用美国特有的Iodent群与西南区改良的瑞德进行组配，才能组配出高产，优质，多抗，适应性广的组合。当然，不能完全依据分子标记结果来推断玉米自交系间的杂种优势，还应该结合自交系间的系谱、配合力以及田间表现来划分合理的杂种优势群，才能对自交系进行更适宜生产应用的改良和创新。

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Analysis of SSR markers in seven southwest corn backbone inbred lines and 49 United States corn inbred lines

ZHAOXiao-min1，BAIGuang-xiao1，RENHong2，YANGWen-zhu3

(1.CollegeofAgricultural，GuizhouUniversity，Guiyang，Guizhou550025，China; 2.GuizhouProvincialCropSeedrStation，Guiyang，Guizhou550001，China; 3.InstituteofUplandCrops，GuizhouAcademyofAgriculturalSciences，Guiyang，Guizhou550009，China)

41 SSR primers were applied to analyze genetic diversity in 49 U.S. corn inbred lines and 7 southwest backbone inbred lines. A total of 169 alleles were detected with an average of 4.12 per SSR primer pair， ranging from 2～10. The polymorphism information content (PIC) of SSR primers ranged from 0.299 to 0.885， with a mean of 0.652. According to the UPGMA method， the test inbred lines could be divided into seven groups by clustering with the genetic distance of 0.572 as the benchmark. Clustering analysis of SSR markers for 56 inbred lines showed that 78% of U.S. corn inbred lines and southwest backbone inbred lines had significant genetic differences， which were clustered into four groups. While 22% of U. S. corn inbred lines and southwest backbone inbred lines had certain homologous origin， which were clustered into three (Ⅰ， Ⅳ and Ⅵ) groups. Through the analysis of SSR marker of U.S. corn germplasm and southwest maize germplasm， the study can provide the reference for the improvement， innovation and utilization of maize breeding material in southwest China.

Southwest backbone inbred lines; U. S. corn inbred lines; SSR molecular marker; cluster analysis； use and improvement

2016-11-22；

2016-12-07

贵州省科技攻关项目[黔科合NY(2011)3014号]。

S513

A

1008-0457(2017)01-0024-06 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.004

*通讯作者：柏光晓(1962-)，女，教授，主要研究方向：玉米遗传育种；E-mail： xiaobg06@163.com。