大麻种子萌发时总糖和还原糖含量的动态变化及其检测方法优化

郭 蓉，郭孟璧，陈 璇，陈秋羽，许艳萍，郭鸿彦，杨 明，张庆滢*

(1. 云南省农业科学院经济作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南农业大学 园林园艺学院，云南昆明 650201)

大麻种子萌发时总糖和还原糖含量的动态变化及其检测方法优化

郭 蓉1，郭孟璧1，陈 璇1，陈秋羽2，许艳萍1，郭鸿彦1，杨 明1，张庆滢1*

(1. 云南省农业科学院经济作物研究所，云南 昆明 650205；2.云南农业大学 园林园艺学院，云南昆明 650201)

以工业大麻品种云麻1号和M641萌发过程中的种子为实验材料，对DNS法(3，5-二硝基水杨酸法)测定还原糖的条件进行了研究，并采用蒽酮法测定总糖含量，分析了大麻种子在萌发过程中总糖和还原糖的动态变化。结果显示，DNS法测定还原糖的最佳检测条件为：检测波长530 nm，DNS用量2 mL，显色时间7 min。在种子萌发过程中还原糖和总糖的含量表现出先下降后上升，但整体呈上升趋势，其中，云麻1号和M641的总糖含量总体升幅分别为158%和78%，还原糖含量总体升幅分别为671%和703%。本研究探明了大麻种子萌发过程中总糖和还原糖含量的变化，可为大麻种子萌发机理研究提供参考，同时也可为今后大麻植物及种子中的还原糖和总糖的测定提供借鉴。

大麻种子；总糖；还原糖；DNS法；蒽酮法

大麻(Cannabissativa. L)为大麻科大麻属一年生草本植物，是一种具有悠久种植历史的传统作物，集药用、纺织、造纸和食用、饲用等多种用途于一身[1]。目前，随着对其药用价值的深入研究和市场认知度的不断提高，大麻产业已成为中国乃至全世界应用广泛、颇具竞争力的新兴产业。大麻种子作为大麻产业发展的物质基础，其品质优劣和萌发机制决定着播种后能否正常萌发和生长。因此，只有严格把好种子这一关，才能保障大麻产业的健康有序发展。

目前，在大麻种子方面的研究仅见大麻种子发芽条件、种子生活力及抗炎活性成分或大麻籽仁组分及营养价值等方面的零星报道[2-5]，而对其萌发期间总糖和还原糖含量的变化尚未见相关文献。虽然目前有不少采用DNS法测定还原糖或多糖的研究，但是不同测量对象其测定条件也存在一定差异[6，7]。因此，本研究对影响其测定结果最关键的因素如检测波长、DNS用量和显色时间等进行探讨，并进行方法学考察。同时，采用DNS法和蒽酮法建立大麻种子中还原糖和总糖的测定方法，并对其萌发过程中还原糖和总糖的含量进行测定，探究其动态变化规律，为研究大麻种子萌发机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与仪器

本地主栽工业大麻品种云麻1号和云南地方品种M641的种子。2015年12月于云南省农业科学院经济作物研究所工业大麻良种繁育基地收获，选取成熟良好、外观均匀一致的种子常温保存2个月)。

BIOMATE 3S紫外-可见光分光光度计。

1.2 实验试剂

DNS试剂和标准葡萄糖溶液(1 mg/mL)的配制参照舒馨等研究方法配制[7]。

蒽酮试剂和标准葡萄糖溶液(100 μg/mL)的配制参照刘海英和李文砚等方法配制[8-9]。

1.3 测定方法

1.3.1 样品制备 称取大麻种子2.0 g，用滤纸床播种，于28℃暗培养[10]。从大麻种子吸胀开始，分别于0 h、3 h、6 h、12 h、18 h、24 h、30 h、42 h、54 h、66 h、78 h、102 h取样，将样品烘干后研磨备用。

1.3.2 供试品样液的制备 精密称取经研磨的大麻种子样品1.0 g置入50 mL锥形瓶中，加入50 mL蒸馏水混匀，于50℃水浴保持60 min，过滤收集滤液至100 mL容量瓶中冷却定容[11]。

1.3.3 DNS比色法测定还原糖实验方法的确立

1.3.3.1 DNS法测定波长的确定

取1 mL葡萄糖标准液及1 mL蒸馏水分别置于10 mL试管中，再各加入2 mL DNS试剂，沸水浴加热7 min，流水冷却，蒸馏水定容。将葡萄糖显色液-水(空白)、DNS试剂-水、葡萄糖显色液-DNS 试剂分别在波长480～600 nm 范围内进行扫描。

1.3.3.2 DNS试剂用量的确定

在精确加入1 mL葡萄糖标准液的系列10 mL试管中，分别加入1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、5.0 mL DNS 试剂，沸水浴加热7 min，流水冷却，蒸馏水定容。以相同条件下不加葡萄糖标准液作空白溶液，波长530 nm下测定添加不同用量DNS 试剂溶液的吸光度值。

1.3.3.3 DNS试剂显色时间的确定

取1 mL葡萄糖标准液及1 mL蒸馏水于系列10 mL试管中，分别加入2 mL DNS 试剂，置沸水浴中加热反应2、3、5、7、10、15、20 min，流水冷却，蒸馏水定容。以相同条件下不加葡萄糖标准液作空白溶液，波长530 nm下测定不同加热时间溶液的吸光度值。

1.3. 4 DNS法测定还原糖的标准曲线绘制 精密量取1 mg/mL标准葡萄糖溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于试管中，补加蒸馏水至1.2 mL，再分别加入2 mL DNS显色剂，沸水浴7 min后取出流水冷却定容至25 mL的容量瓶中。以试剂空白为参比液，在波长为530 nm下用分光光度计测定，每组测定三次，取平均值。

1.3.5 方法学考察

1.3.5.1 精密度实验

取同一还原糖供试品样液，以1.3.3研究得到的检测方法重复测定6次，记录吸光度值，并计算其RSD值。

1.3.5.2 回收率实验

精密称取已知还原糖含量的同一批萌发大麻种子样品1 g，共9份，按还原糖含量的80%、100%、120%分别加入无水葡萄糖对照品。其余按供试品样液制备方法进行制备并对还原糖含量进行测定，计算回收率。

1.3.6 蒽酮法测定总糖的标准曲线绘制 精密量取100 μg/mL标准葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8 mL于试管中，补加蒸馏水至1.0 mL，再分别加入5 mL蒽酮试剂，沸水浴10 min后取出流水冷却，以试剂空白为参比液，在620 nm波长下用分光光度计测定，每组测定三次，取平均值。

1.3.7 还原糖和总糖的测定 还原糖以1.3.3研究得到的检测方法进行测定，总糖参照文献采用蒽酮法进行测定[9]。

2 结果与分析

2.1 DNS法测定还原糖体系的优化

2.1.1 DNS法测定波长的确定 吸收光谱图(图1)显示：在530 nm处显色剂-水的吸光度值接近于0，葡萄糖显色液-水和葡萄糖显色液-显色剂的吸光度值接近重合，因此，为了消除测定过程中显色剂的影响，本研究最终选择测定波长为530 nm。

图1 葡萄糖显色液及对比溶液的吸收光谱图Fig. 1 The absorption spectrum with glucose solution and contrast solution

2.1.2 DNS用量确定 由图2可知，吸光度随着DNS用量的增加呈现先增加后缓慢下降的趋势，DNS用量在2.0 mL时，吸光度值达到最大且稳定，因此本研究确定DNS的最佳用量为2 mL。

图2 DNS用量对吸光度的影响Fig. 2 Effect of different DNS dosage on absorbance

2.1.3 DNS显色时间的确定 从图3可以看出，随着水浴时间的增加，吸光度随之增大，在水浴7 min时吸光度值最大，其后一直保持稳定，因此，本研究选择显色时间为7 min。

图3 显色时间对吸光度的影响Fig.3 Effect of the reaction time on absorbance

2.2 线性关系考察

以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标作图，得到还原糖测定的标准曲线回归方程：A=23.239C+0.0125，R2=0.9994。结果表明，葡萄糖浓度在0.008～0.048 g/L 之间与吸光度呈良好的线性关系。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度实验 对同一还原糖供试品样液依法重复测定6次，其吸光度值分别为0.075、0.075、0.074、0.076、0.075、0.077，n=6，RSD为1.37%，说明实验精密度良好。

2.3.2 回收率实验 还原糖供试品样液的回收率如表1所示，说明采用DNS法测定萌发大麻种子中的还原糖，方法可行，数据准确可靠。

表1 还原糖回收率实验Tab.1 The recovery of reducing sugar

2.4 蒽酮法测定总糖的标准曲线

以葡萄糖浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标做图，得到总糖标准曲线回归方程为：A=0.025C+0.0181，R2=0.9993。结果表明，葡萄糖浓度在0.0042～0.025 g/L 之间与吸光度线性关系良好。

表2 萌发过程中总糖(蒽酮法)和还原糖(DNS法)的含量变化Tab.2 The content of total sugar(by Anthrone method) and reducing sugar(by DNS method) in the process of germination

2.5 萌发过程中总糖和还原糖的含量及变化

不同萌发时期云麻1号和M641的总糖和还原糖含量变化见表2。从表2可以看出，随着萌发时间的延长两个品种的还原糖含量缓慢持续降低，至24 h达到最低，24 h后还原糖含量开始增加；而总糖含量从萌发开始一直持续降低直至54h降至最低，54 h后总糖含量开始增加；在24 h～54 h内，还原糖含量随总糖含量的降低而升高，在54 h～102 h还原糖的含量随总糖含量增加而增加。萌发至24h时，云麻1号和M641还原糖的含量分别下降82.9%和17.8%，萌发至102 h还原糖含量分别增加为原含量的7.71倍和8.03倍。萌发至54 h时，云麻1号和M641总糖的含量分别下降31.9%和47.8%，萌发至102 h总糖含量分别增加为原含量的2.58倍和1.78倍。总的来说，在大麻种子萌发过程中无论是同一品种还是不同品种之间还原糖和总糖的变化趋势基本一致，都呈现出先缓慢下降后上升的趋势。

3 结论与讨论

3.1 DNS法是检测各类植物及植物种子中还原糖和总糖的常用方法[7，12-13]，操作简便、快速、灵敏度高，而且实用性强，已广泛用于各种研究及生产上。本研究对影响还原糖测定的因素比如吸收波长、显色时间和显色剂用量进行了考察，关于波长的选择在已知文献中已有不少研究，如在枸杞中采用的是540 nm[6]，在八角中采用的是489 nm[7]，在铁皮石斛中是520 nm[11]，而在本研究中最佳检测波长为530 nm，这可能与大麻作物种子成分特性及组成比例等因素有关。本研究最终确定的DNS法测定还原糖最佳体系为：检测波长530 nm，DNS用量2 mL，显色时间7 min。

3.2 工业大麻种子在萌发过程中其糖类物质的变化规律是研究大麻种子萌发机理的重要方面。本文初步探明了工业大麻种子萌发过程中可溶性总糖和还原糖的含量动态变化规律。研究结果显示，大麻种子在整个萌发过程中还原糖和总糖的含量均是先下降后上升，其中，在0～54 h内，总糖含量一直呈现下降趋势，可能是萌发初期大麻种子在利用脂肪等大分子物质之前优先利用小分子糖[14-15]，而还原糖含量变化不明显，虽然在24 h出现了一个较低值，但整体呈较稳定的状态。而萌发54 h后，总糖和还原糖的含量均呈现快速上升趋势，这可能与脂肪酶活性的不断增加将粗脂肪降解转化成糖类或是蛋白质通过脱氨基作用转化为糖类有关[16-17]。

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Dynamic Changes of Total and Reducing Sugar in the Germination Process of Hemp Seeds and Optimization of Test Method

GUORong1，GUOMeng-bi1，CHENXuan1，CHENQiu-yu2，XUYan-ping1，GUOHong-yan1，YANGMing1，ZHANGQing-ying1*(1.IndustrialCropResearchInstitute，YunnanAcademyofAgriculturalSciences，Kunming，Yunnan650205，China； 2.GardenandHorticultureInstitute，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming，Yunnan650201，China)

Dynamic changes of total sugar (by Anthrone method) and reducing sugar (by DNS method) in the process of hemp seed germination were investigated using seeds from two hemp (CannabissativaL .) varieties YunMa 1 and M641. The results showed that the optimum determination wavelength of DNS method was 530 nm， the proper volume of DNS reagent was 2.0 mL， and the optimal time for colour reaction was 7 min. The contents of total and reducing sugar increased distinctly after a slow declining in early stages of the germination process. The contents of total sugar of YunMa 1 and M641 increased by 158% and 78% respectively， and the reducing sugar increased by 671% and 703% respectively. The dynamic changes of total and reducing sugar in the germination process of hemp seeds revealed in this paper could provide reference for the research of germination mechanism and also for the determination of carbonhydrate of hemp seeds.

hemp seed； total sugar； reducing sugar； 3，5-Dinitrosalicylic acid (DNS)； Anthrone

2016-10-12；

2017-02-06

国家自然科学基金项目(31360350)；云南省重点新产品项目 (2016BB005)。

S563

A

1008-0457(2017)01-0050-04 国际

10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2017.01.009

*通讯作者：张庆滢(1973-)，女，硕士，副研究员，主要研究方向：大麻资源与育种研究；E-mail：zhqy0033@sina.com。