顶空气相色谱法测定替硝唑原料药中6种有机溶剂的残留量

王瑞芬

（濮阳市食品药品检验检测中心，河南 濮阳 457000）

替硝唑（tinidazole），化学名2-甲基-1-[2-（乙基磺酰基）乙基]-5-硝基-1H咪唑，是新一代硝基咪唑类抗厌氧菌药物。该药由美国Pfizer公司研究开发，1971年首次在德国上市，1993年获国家卫生部颁发的新药证书，并在国内上市。该药对原虫（溶组织阿米巴、阴道滴虫等）和厌氧菌有良好活性，可用于治疗滴虫病、贾第鞭毛虫病、阿米巴病、细菌性阴道炎和厌氧菌感染；可与抗生素和抗酸药联合应用，用于治疗与幽门螺旋杆菌相关的十二指肠溃疡等，具有疗效显著，疗程短，副作用小等优点。为保证药品用药安全、质量可控，根据人用药品注册技术要求国际协调会（ICH）指导原则和《中国药典》2020年版四部通则“残留溶剂测定法”中的有关规定，需对本品合成工艺中使用的有机溶剂残留量进行检测。根据文献报道的替硝唑合成路线[1-6]，在替硝唑原料药合成过程中可能会用到乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯等6种有机溶剂，这些溶剂残留会对人体健康造成安全隐患。目前，有关替硝唑原料药中残留溶剂的研究文献尚未见报道。本文在参考相关文献的基础上[7-9]，建立了一种气相色谱同时测定替硝唑原料药中6种残留溶剂的方法，有望为替硝唑原料药的质量控制及生产检测提供必要参考。

1 仪器与试药

安捷伦 7890B 气相色谱仪、7697A顶空进样器、氢火焰离子化检测器（美国Agilent 公司），METTLER TOLEDO XS205DU 电子分析天平[梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司]。

替硝唑原料药（批号：R H 2 4 3 3 1 2，RH243315，RH243318，购自上海），乙醇、丙酮、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯（国药集团化学试剂有限公司，均为优级纯，含量：≥99.5 %），异丙醇（上海麦克林生化科技有限公司，分析纯，含量 ≥99.5 %），二甲基亚砜（德国默克公司，含量：≥99.9 %）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624毛细管柱（30 m×0.53 mm，3.0 µm)；升温程序：初始温度40 ℃，保持8 min，以10 ℃/min速率升温至150 ℃，保持5 min；进样口温度：230 ℃；FID检测器，检测器温度：260 ℃；载气：高纯氮气，流速：2.5 ml/min；分流比：10:1；顶空进样量：1.0 ml，平衡温度：85 ℃，平衡时间：30 min。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 精密称取乙醇250 mg、丙酮250 mg、异丙醇250 mg、乙酸乙酯250 mg、二甲苯108.5 mg置入50 ml量瓶，另精密移取浓度为3 mg/ml三氯甲烷溶液（精密称取三氯甲烷75 mg置入25 ml量瓶，加二甲基亚砜溶解并稀释至刻度，摇匀，即得）1 ml置入同一50 ml量瓶，加二甲基亚砜溶解，定容，摇匀，得混合对照品储备液。精密吸取混合对照品储备液1 ml置入20 ml量瓶，用二甲基亚砜稀释至刻度，得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取替硝唑原料药约0.5 g，精密称定，置顶空瓶中，精密加入二甲基亚砜5 ml，压盖密封，振摇使溶解，即得。

2.2.3 空白溶液 精密移取二甲基亚砜5 ml，置顶空瓶中，压盖密封，即得。

2.3 系统适用性试验

吸取混合对照品溶液、供试品溶液和空白溶液各5 ml分别置入相应的顶空瓶，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图（见图1）。由色谱图分析结果可见，在该色谱条件下，各有机溶剂色谱峰均可实现基线分离，分离度大于1.5，理论塔板数以丙酮峰计算大于30000，二甲基亚砜对待测成分无干扰，二甲基亚砜峰和各待测组分色谱峰之间分离度良好。

图1 气相色谱图

2.4 线性关系考察

精密吸取2.2.1项下混合对照品储备液0.2，0.5，1.0，2.5，5.0 ml分别置入20 ml量瓶，加二甲基亚砜稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。取5 ml上述溶液置入20 ml顶空瓶，按2.1项下色谱条件分析测定，记录相应峰面积，以待测有机溶剂的浓度X为横坐标，峰面积Y为纵坐标进行线性回归，得回归方程，结果见表1。

表1 6个成分的回归方程、相关系数和线性范围

2.5 定量限（LOQ）与检测限（LOD）

取适量混合对照品溶液，逐级稀释，得不同浓度的混合对照品稀释液，分别按2.1项下色谱条件分析测定，以信噪比（S/N）为10时对应的浓度为定量限，信噪比（S/N）为3时对应的浓度为检测限，结果表明：乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的定量限分别为 1.8437，1.4653，1.9014，1.2063，4.070，2.8786 mg/L，检测限分别为0.5531，0.4396，0.5704，0.3619，1.221，0.8636 mg/L。

2.6 精密度试验

取2.2.1项下混合对照品溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，测得乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的峰面积的RSD分别为0.39 %，0.78 %，0.79 %，0.91 %，1.21 %，0.64 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取替硝唑原料药（批号：RH243318），按2.2.2项下方法制备供试品溶液，分别于室温下放置0，2，4，8，12和24 h后，按2.1项下色谱条件分析测定，得乙醇、异丙醇峰面积的RSD分别为1.47 %，1.23 %（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

2.8 重复性试验

取替硝唑原料药（批号：RH243318），按2.2.2项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析测定，结果检出乙醇、异丙醇含量的RSD分别为1.13 %，1.02 %（n=6），该分析方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取替硝唑原料药（批号：RH243318）约0.5 g，共9份，精密称定，置入顶空瓶，分别加入5 ml浓度为80 %，100 %，120 % 的混合标准溶液，每个浓度制备3份平行样。按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算加样回收率。结果乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯的平均加样回收率分别为98.75 %，100.03 %，99.33 %，98.58 %，97.92 %，101.12 %，RSD分别为1.38 %，2.17 %，1.78 %，1.52 %，1.47 %，1.06 %。表明此法用于检测替硝唑原料药中6种残留溶剂准确度良好。

2.10 样品中残留溶剂的测定

取替硝唑原料药（批号：R H 2 4 3 3 1 2，RH243315，RH243318）约0.5 g，精密称定，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析测定，记录峰面积，计算有机溶剂残留量，结果见表2。

表2 替硝唑原料药残留溶剂测定结果

3 讨论

本研究参考《中国药典》2020年版（四部）通则中残留溶剂测定法，采用氢火焰离子化检测器，顶空进样测定替硝唑原料药中6种有机溶剂的残留。顶空进样法可免除复杂的样品前处理过程，规避原料药及溶剂中杂质对分析测定的干扰，减少难挥发性物质对色谱柱及进样口的污染。因替硝唑微溶于水，本文选用二甲基亚砜溶解样品，可使待测有机溶剂在顶空瓶中的达到一定的气液平衡，具有较高的灵敏度。

分别考察了顶空平衡温度和时间对试验结果的影响，结果表明，平衡时间为30 mim时，平衡温度为70，75，80，85，90 ℃时，随升高温度，检测灵敏度提高，相应色谱峰峰面积增大，当温度大于85 ℃ 时，峰面积增大不明显，同时兼顾温度升高顶空瓶气密性变差、样品热分解增大，都将对试验结果造成不利影响，将平衡温度设为85 ℃。在平衡温度85 ℃时，分别考察平衡时间15，20，30，40 min对待测组分的影响，结果表明，各待测组分的色谱峰面积在平衡时间30 min后增加趋缓，为节约检验成本，提高分析效率，平衡时间确定为30 min。

试验过程中，由于二甲苯中两个甲基存在位置异构，为邻二甲苯、对二甲苯和间二甲苯三种异构体的混合物，反应在混合对照品色谱图中，在保留时间18～20 min范围内，出现3个色谱峰，故以3个峰面积之和进行定性和定量分析。

本研究考察了分流比为5:1，8:1，10:1，12:1，15:1条件下的试验情况，结果表明，随分流比增加，各待测成分色谱峰峰宽变窄，峰形尖锐，峰面积与峰高均减小。从分析参数优化和满足不同浓度定量分析的需要出发，最终确定分流比为10:1。

本研究建立的分析方法可实现快速、准确、高效的测定替硝唑原料药中乙醇、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、三氯甲烷和二甲苯6种有机溶剂的残留量，可为替硝唑原料药及其制剂的标准提升提供参考依据。