加速溶剂萃取-超高效液相色谱-串联质谱法测定大枣中3种五环三萜酸

张 萍，何 婷，王 颖，胡克特，顾 丁，陈荣祥

（遵义医科大学 基础医学院，贵州 遵义 563000）

大枣为鼠李科植物枣树（Ziziphus jujuba Mill.）的干燥成熟果实，不仅作为食物，还是传统中医药中的常用药材。大枣富含氨基酸、多糖、三萜酸、环核苷酸和黄酮类化合物，有抗过敏、抗肿瘤、镇静、保肝、抗炎、抗氧化等药理作用[1-2]。研究表明，五环三萜酸是大枣的主要活性成分之一，主要包括齐墩果酸、熊果酸、桦木酸等[3]。现代药理研究发现，枣中桦木酸、齐墩果酸和熊果酸对多种疾病有治疗作用。齐墩果酸有抑制细菌生长、降低血脂、保肝、增强免疫力等生理功能[4]。熊果酸有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、保肝、降血糖作用[5]。桦木酸有显著的抗肿瘤和抗病毒作用，及抗炎、抗糖尿病、抗高血脂等药理作用[6]。因此，研究大枣中五环三萜酸的含量和组成对其质量控制有积极意义。

加速溶剂萃取法（ASE）是一种利用传统的液体溶剂在高温高压下提取化合物的自动化提取技术，有回收率高、速度快、溶剂用量少等优点[7]，在萃取复杂体系中化合物方面有一定优势，可用于提取食品、药品中的多环芳烃、无机离子和药物残留等[8-13]。有文献[14]证明采用ASE萃取中草药中的齐墩果酸和熊果酸的提取效率优于超声提取法。但目前尚未见大枣中多种五环三萜酸的的ASE提取相关报道。

目前，植物源五环三萜酸的检测方法主要采用高效液相色谱法，紫外检测器/二极管阵列检测器[15-16]、蒸发光散射检测器[17]、串联质谱（MS/MS）检测器[18]等均可用于检测[19-20]。五环三萜酸最大吸收波长在200 nm附近，但干扰严重，响应较低，对于含量较高的中草药可直接测定，而对低含量的样品灵敏度不足，如大枣、赤芍中的五环三萜酸需用分散液-液萃取、离子液体萃取等方式加以富集[21-22]。相对于光学检测器，MS/MS灵敏度高，与超高液相色谱法（UPLC）联用可进一步缩短分离时间、提高灵敏度。研究表明，采用UPLC可将齐墩果酸和熊果酸的分离时间由20～40 min缩短至约10 min[23-24]。本研究拟采用ASE从大枣中提取齐墩果酸、熊果酸和桦木酸（化学结构式见图1），用UPLC分离，MS/MS进行检测，为筛选优质品种枣和开发大枣保健功能食品提供技术支持。

图1 齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的化学结构式

1 仪器与材料

1.1 仪器

ACQUITY UPLC-Xevo TQ-S超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪，MassLynx V.4.1工作站软件控制（美国Waters公司）；ASE-350型加速溶剂萃取仪（配有34 ml不锈钢萃取池，赛默飞世尔科技公司）；SB-5200DT型超声波清洗机（宁波新芝生物科技股份有限公司）；ME104E电子天平，FE28 pH计[梅特勒-托利多国际贸易（上海）有限公司]；PURELAB Chorus 2纯水及超纯水系统（英国埃尔格）；microfuge 20离心机（德国贝克曼）；0.22 μm尼龙滤膜[月旭科技（上海）有限公司]。

1.2 材料

乙腈（质谱纯，霍尼韦尔贸易有限公司）；齐墩果酸对照品（批号E1525063，纯度大于97 %），熊果酸标准品（批号L1411037，纯度大于98 %），甲醇、氨水、乙酸铵为色谱纯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；桦木酸对照品（批号AMW002，纯度大于97 %，Ark Pharm）；硅藻土（赛默飞世尔科技公司）。其他试剂均为分析级。大枣购自当地市场。

2 方法与结果

2.1 含量测定

2.1.1 供试品溶液的制备 将大枣样品切片，90 ℃烘干后粉碎过60目筛，精密称取粉碎均匀的试样0.5 g，加入硅藻土混合均匀，装入34 ml萃取池中进行萃取。萃取条件：提取溶剂80 %甲醇水溶液，萃取温度100 ℃，压力1500 psi，循环1次，静态萃取时间15 min，冲洗体积为提取池体积50 %。氮气吹扫60 s。收集全部提取液于量瓶中，并定容至100 ml，10 000 r/min离心10 min后过0.22 μm尼龙滤膜即得。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸、熊果酸、桦木酸的对照品，用甲醇溶解并定容于10 ml量瓶中，配制成浓度为1 mg/ml的对照品储备液。使用时，根据需要移取对照品储备液适量，以甲醇稀释，配制成系列质量浓度的混合对照品工作液。

2.1.3 液相色谱条件分析 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C18柱（2.1 mm ×100 mm，1.7 μm）；流动相A相：乙腈；B相：15 mmoL/L乙酸铵溶液（氨水调节pH 9.3），采用梯度洗脱，0～4 min，75 %A，4～5 min为75 %A→95 %A，5～6.5 min为95 % A，6.5～7 min为95 %A→75%A，体积流量0.2 ml/min，柱温35 ℃，进样量1 μl。

2.1.4 质谱条件 电喷雾离子源，在负离子检测模式下多反应监测（MRM）检测。毛细管电压：3.5 kV：蒸发温度600 ℃；气流量：750 L/h。进一步对锥孔电压、碰撞能量等进行优化，结果见表1。

表1 3种化合物质谱参数

2.2 提取条件的优化

2.2.1 ASE条件的优化 ASE的提取效率主要取决于提取溶剂的种类、提取温度、提取次数和静态提取时间。本研究中，所有提取均在1500 psi下进行，提取池的冲洗体积为50 %，用氮气吹扫60 s。

2.2.2 提取溶剂的优化 本实验以甲醇为提取溶剂，考察不同体积分数的甲醇对3种组分提取效果的影响（见图2）。结果表明，当甲醇体积分数为80 %时，3个组分的提取效率均达到最高。当甲醇体积分数大于80 %，提取率下降，因此可确定甲醇的体积分数为80 %。

图2 甲醇体积分数对于提取效率的影响

2.2.3 提取温度的优化 温度是影响提取回收率的重要因素，本实验考察了不同温度（60，80，100，110，120 ℃）对3种组分提取效率的影响（见图3）。结果表明，100 ℃时3组分的提取率最高，超过100 ℃时，提取效率逐渐降低，因此，可确定提取温度为100 ℃。

图3 温度对于提取效率的影响

2.2.4 提取时间的优化 采用80 %甲醇在100 ℃下考察不同提取时间（静态提取3，10，15，20，30 min）对3组分提取效率的影响（图4）。结果表明，15～20 min时，3组分的提取率最高。因此，选择提取时间为15 min。

图4 提取时间对于提取效率的影响

2.2.5 提取次数优化 本实验考察了不同提取次数对3种组分提取效果的影响（见图5）。结果表明，提取1～3次时，3种组分峰面积基本保持不变，为了减少提取时间，节省溶剂，选择提取次数为1次。

图5 提取次数对于提取效率的影响

2.2.6 色谱条件优化 采用UPLC EBH C18柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）为固定相，考察乙酸铵水溶液pH值（氨水浓度调节pH 7～10）对分离的影响。结果表明，当流动相的pH＞9时，3种分析物的响应更强，分离度更好。最终选择乙腈和乙酸铵（15 mmol/L，pH 9.3）为流动相。

2.2.7 质谱条件的优化 以甲醇为溶剂，制备齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的对照品溶液，浓度为300 μg/L。在全扫描模式下选择前体离子，在负电离模式下优化锥孔电压。然后在产物离子扫描模式下选择产物离子，在MRM模式下优化了各产物离子的碰撞能量。优化的前体离子、产物离子和碰撞能量参数见表1。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性方程、相关系数和检出限 精密称取齐墩果酸、熊果酸、桦木酸对照品适量，配成混合对照品溶液，在同一色谱条件下进样，确定标准物质的保留时间，然后各取一定体积配成不同浓度的混合对照品溶液，进样量1 μl，记录色谱图，以峰面积对浓度（mg/L）进行线性回归，3种化合物的线性范围、回归方程、相关系数及检出限见表2。齐墩果酸、熊果酸、桦木酸在0.5～10 mg/L浓度范围内，线性关系良好。3种分析物的信噪比为3时的LOD分别为54，13，42 μg/L。

表2 线性方程与范围、检出限结果

2.3.2 加标回收试验 精确称取已测得含量的大枣样品0.5 g，分别准确加入一定量的对照品，根据优化的提取条件对加标样品进行处理，并在相同的色谱条件下进行分析，将测得的峰面积代入回归方程计算各化合物的含量，并计算回收率，结果见表3。齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的回收率分别为98.4 %～101.3 %，97.3 %～101.7 %，93.6 %～96.1 %，RSD分别为1.18 %～5.30 %，4.79 %～6.83 %，2.50 %～6.19 %之间，表明回收率良好。

表3 加标回收试验结果

图6 3种对照品（A）和样品（B）化合物的色谱图

2.4 基质效应

基质效应是指从基质中洗脱的其他组分对ESI源的影响，在电离过程中会对目标化合物产生抑制或增强作用，从而影响检测的准确度和检出限。本文比较了在基质和空白溶剂中制备标准曲线的斜率，以评价基质效应。以大枣提取物为原料，制备了0.5，1，2，5，10 mg/L系列基质匹配溶液。计算方法如下：基质效应（%）=基质匹配样品溶液的平均斜率/标准溶液（甲醇配制）的平均斜率×100 %。结果表明：齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的基质效应分别为98.61 %，92.67 %，95.82 %，样品与溶剂之间无显著的基质效应。

2.5 样品测定

根据优化后的ASE条件处理样品，得供试品溶液，利用质谱进样分析，计算结果见表4。

表4 样品含量测定结果/mg·kg-1

2.6 ASE与超声提取的比较

本研究比较了ASE和超声辅助提取[25]对大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的提取效率，结果见表5。ASE提取大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸的含量优于超声辅助提取法。因此，ASE更适于枣中五环三萜酸的提取。

表5 ASE与超声提取效果比较

3 结论

本研究建立了一种基于ASE-UPLC-MS/MS测定大枣中齐墩果酸、熊果酸和桦木酸含量的方法。与超声辅助提取相比，该提取方法更有效，自动化程度更高。采用弱碱性流动相和UPLC色谱柱，在5 min内分离出3种化合物，与其他色谱方法相比，大大缩短了分析时间且灵敏度显著高于液相色谱法。本方法简便、快速、准确、可靠，适用于大枣中齐墩果酸和熊果酸、桦木酸的同时测定。