顶空气相色谱法测定奥贝胆酸原料药中有机溶剂的残留量

付丙月，吴伟山，张 宁，王金虎*

（1.山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室， 山东 济南 250101；2.山东中医药大学附属医院骨科，山东 济南 250101）

奥贝胆酸（obeticholic acid，OCA），商品名Ocaliva，通过活化法尼醇X受体，间接抑制细胞色素7A1（CYP7A1）的基因表达，是一种法尼醇X受体特异性激动剂，由Intercept公司研发，美国FDA于2016年5月27日有条件加速批准其用于治疗原发性胆汁性胆管炎，是近20年首个获得美国FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化和非酒精性脂肪性肝病的药物[1-5]。目前，尚未见奥贝胆酸原料药中有机溶剂残留量测定的文献报道。本文针对其合成反应中使用的甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯等有机溶剂进行检测[6-13]。根据ICH和《中国药典》2015年版（四部）附录0861的相关规定，采用气相色谱法（GC）顶空进样方式，对奥贝胆酸原料药中10种有机溶剂的残留量进行同时测定，以确保药品的安全性、有效性和质量可控性[14-16]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Agilent 7890B型气相色谱仪，包括氢火焰离子化检测器（FID）、7697E型顶空进样器（美国安捷伦）；XS-205型电子天平（梅特勒-托利多公司）。

1.2 试药

奥贝胆酸原料药（批号：20160310，纯度：99.9 %；批号：20160315，纯度：99.8 %；批号：20160321，纯度：99.9 %；批号：20160329，纯度：99.9 %；批号：20160401，纯度：99.9 %；批号：20160414，纯度：99.9 %；批号：20160429，纯度：99.9 %；批号：20160511，纯度：99.8 %；批号：20160523，纯度：99.9 %），本研究院根据不同合成路线自制[6-13]；N,N-二甲基甲酰胺（分析纯），甲醇（色谱纯），正己烷（分析纯），乙腈（色谱纯，天津康科德）；甲苯（分析纯），乙酸乙酯（分析纯），二氯甲烷（分析纯，国药集团）；四氢呋喃（分析纯），三乙胺（分析纯，天津富宇）；无水乙醇（分析纯，天津科密欧）；异丙醇（分析纯，山东禹王和天下新材料有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent DB-624毛细管柱（30 m×0.53 mm，3.0 μm）；程序升温：起始温度40 ℃，保持6 min，以30 ℃/min的速率升温至220 ℃，保持8 min；检测器温度：220 ℃；进样口温度：220 ℃；载气：氮气，流速3.0 ml/min；分流比：5:1；进样方式：顶空进样；进样瓶体积为10 ml；顶空平衡温度：85 ℃；平衡时间：30 min。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称量甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯，置入100 ml量瓶，加入N,N-二甲基甲酰胺并稀释至刻度，摇匀，制成浓度分别为300，500，500，41，60，29，500，72，500，89 μg/ml的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密称取奥贝胆酸50 mg，置入10 ml顶空瓶，加入5 ml N,N-二甲基甲酰胺，密封，轻轻摇匀，即得。

2.2.3 空白溶剂对照 精密量取5 ml N,N-二甲基甲酰胺，置入10 ml顶空瓶，密封，即得。

2.3 系统适用性试验

按2.1项下色谱条件，取空白溶剂和混合对照品溶液分别进样，记录色谱图。由色谱图可见，对照品溶液中各待测溶剂出峰顺序依次为：甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯，空白溶剂N,N-二甲基甲酰胺对测定无影响，混合对照品中各组分分离度良好，R值均大于2，详见图1～3。

图1 空白溶剂气相色谱图

图2 系统适用性气相色谱图

图3 奥贝胆酸样品（批号：20160523）气相色谱图

2.4 线性关系考察

分别精密量取2.2.1项下的混合对照品储备液各0.5，1.0，2.0，5.0，10.0，25 ml，置入25 ml量瓶，加N,N-二甲基甲酰胺稀释至刻度，摇匀，制成一系列不同浓度的线性混合对照品溶液。精密量取线性混合对照品溶液5 ml，置入10 ml顶空瓶，密封。根据2.1项下色谱条件测定，记录色谱图。以对照品溶液中各待测成分质量浓度（x，μg/ml）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，结果见表1。

表1 回归方程与线性范围

2.5 定量限与检出限考察

精密量取2.4项下对照品溶液（2 ml→25 ml），N,N-二甲基甲酰胺稀释后，按2.1项下色谱条件进样测定。按信噪比（S/N）10:1考察定量限，结果甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯的定量限分别为6.04，10.02，10.13，0.81，1.22，0.55，10.16，1.45，10.09，1.79 μg/ml。按S/N=3:1考察检测限，结果甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯的定量限分别为2.01，3.35，3.37，0.27，0.41，0.18，3.38，0.48，3.36，0.60 μg/ml。

2.6 精密度试验

精密量取2.2.1项下的混合对照品溶液5 ml，按2.1项下色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯峰面积的RSD分别为2.01 %，1.26 %，1.89 %，2.20 %，2.31 %，1.74 %，1.18 %，2.63 %，2.53 %，1.90 %（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取2.2.2项下供试品溶液（批号：20160523）5 ml，置入10 ml量瓶，加入2.2.1项下混合对照品溶液1 ml，加入N,N-二甲基甲酰胺定容，摇匀，分别于室温下放置0，2，4，6，8，10 h，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯峰面积的RSD分别为1.07 %，1.30 %，0.97 %，1.65 %，1.74 %，1.03 %，0.96 %，1.73 %，1.98 %，1.18 %（n=6），表明供试品溶液在室温下放置10 h内基本稳定。

2.8 重复性试验

精密称取原料药样品（批号：20160523）适量，共6份，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，再按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品残留量。结果甲醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯峰面积均未检出，乙醇的残留量平均值为0.02 %，RSD为1.75 %（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知残留量原料药样品（批号：20160523）适量，共9份，分别加入低、中、高质量浓度的各待测成分对照品溶液适量，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，计算甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、甲苯的加样回收率，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果（n=9）

2.10 奥贝胆酸样品中残留溶剂含量测定

取9批奥贝胆酸原料药样品各适量，按2.2.2项下方法处理后，再按2.1项下色谱条件进样测定，平行测定3次，记录峰面积，以外标法计算甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺、甲苯10种残留溶剂含量，结果表3。

表3 样品中残留溶剂量测定结果（n=3，%）

3 讨论

3.1 待检测样品的选择

经调研发现，奥贝胆酸的合成路线较多，本院为筛选出更优的适宜工业化生产的合成路线，对报道的各合成路线均进行试验，并得到合格的产品。因此，实验中选用本单位根据不同合成方法自制的9批样品。

3.2 进样方式的选择

本试验各待测残留溶剂均为低沸点溶剂，与直接进样方式相比，该方法干净、快速，不会分解出挥发性产物干扰试验结果，故采用顶空进样。

3.3 色谱柱的选择

本研究考察了HP-5、AT-5、DB-WAX和DB-624不同极性的毛细管色谱柱，发现采用DB-624毛细管柱进行测定时，各待测有机溶剂峰之间的分离效果最好，峰形尖锐且对称，灵敏度高，故选择DB-624毛细管色谱柱。

3.4 溶剂的选择

试验中，考察了水、N,N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜、N,N-二甲基乙酰胺作为溶剂，发现奥贝胆酸在水中溶解度较差，在二甲亚砜、N,N-二甲基乙酰胺和N,N-二甲基甲酰胺中完全溶解。以上述3种溶剂分别配制对照溶液，连续进样，发现待测有机溶剂在N,N-二甲基甲酰胺前出峰，稳定性更好，对待测溶剂无干扰，故选择N,N-二甲基甲酰胺作为实验溶剂。

综上，本方法操作简单，准确可靠，为奥贝胆酸原料药的质量控制提供了一种有效手段，适用于奥贝胆酸原料药中甲醇、乙醇、异丙醇、乙腈、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯、四氢呋喃、三乙胺和甲苯残留量的测定。