UPLC法同时测定阿托伐他汀钙中15个杂质含量

时间：2024-07-28

（常州制药厂有限公司，江苏常州 213000）

关健词：超高效液相色谱法；阿托伐他汀钙；有关物质

阿托伐他汀钙是HMG-CoA还原酶的选择性、竞争性抑制剂，能通过抑制肝脏内HMG-CoA还原酶和胆固醇的合成，降低血浆中胆固醇和脂蛋白水平；并通过增加肝细胞表面的低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）受体以增强LDL-C摄取和代谢。阿托伐他汀钙可降低纯合子型和杂合子型家族性高胆固醇血症、非家族性高胆固醇血症和混合型血脂异常患者的总胆固醇（TC），LDL-C和载脂蛋白B水平，为新一代他汀类降血脂药。

现有国内外产品质量标准、各国药典[1-3]及相关文献报道[4-12]中有关物质检测方法，存在分析时间过长、分离度较差等问题，均不能很好分离本文中涉及的15个杂质。经查阅文献，参考各国药典，采用灵敏度和分离度更高、分析速度更快的超高效液相色谱法（UPLC）测定阿托伐他汀钙中的杂质。本论文所建立的检测方法操作简便，结果准确，分离度与重复性好，分析效率高。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津Nexera X2 LC-30AD超高压液相色谱仪，岛津Nexera X2 SPD-M30A光电二极管阵列检测器（日本岛津公司）；Waters Empower 3软件（美国沃特世公司）；XP6百万分之一电子天平，XP205DR十万分之一电子天平，FE20 pH计（瑞士梅特勒公司）。

1.2 试药

阿托伐他汀钙原料药（常州制药厂有限公司，批号：EAT190401，EAT190402，EAT190403，EAT190404，EAT191101，EAT191102，EAT191103，EAT191104）；阿托伐他汀钙，杂质A、B、C、D对照品（USP）；杂质M、O、P对照品（QCCUSA公司）；杂质L、N对照品（Trc公司）；杂质F、G、H、I、J、K（常州制药厂有限公司合成制备，经紫外、红外、质谱和核磁共振分析结构确证）；乙腈，甲醇，N,N-二甲基甲酰胺（DMF），四氢呋喃（无稳定剂）为色谱纯；冰醋酸，醋酸铵为分析纯；试验用水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：岛津Shim-pack Velox PFPP（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流动相A：3.9 g/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调节pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氢呋喃（无稳定剂）=67:21:6:6，流动相B：3.9 g/L醋酸铵缓冲液（用冰醋酸调pH至5.0）:乙腈:甲醇:四氢呋喃（无稳定剂）=27:61:6:6，按表1进行梯度洗脱，流速：0.43 ml/min；检测波长：244 nm；柱温：35 ℃；样品室温度：10 ℃；进样量：1.8 μl；稀释液：DMF。

表1 流动相洗脱梯度

2.2 溶液的制备

杂质定位溶液：依次称取阿托伐他汀钙对照品、杂质A（阿托伐他汀脱氟物）、杂质B （阿托伐他汀非对映异构体）、杂质C （阿托伐他汀双氟物）、杂质D、杂质F（阿托伐他汀二聚物）、杂质G（阿托伐他汀甲酯）、杂质H（阿托伐他汀内酯）、杂质I、杂质J（阿托伐他汀乙酯）、杂质K（阿托伐他汀叔丁酯）、杂质L、杂质M、杂质N、杂质O、杂质P对照品各5 mg，分别置入16个100 ml量瓶，加稀释液溶解稀释至刻度，摇匀。

系统适应性溶液：称取阿托伐他汀钙对照品和杂质A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P对照品各2.5 mg，置入同一50 ml量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。

标准曲线溶液：精密称取阿托伐他汀钙对照品和各杂质A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P对照品各5 mg，分别置入同一100 ml量瓶，加稀释液溶解稀释至刻度，摇匀，再精密移取5 ml至25 ml量瓶，加稀释液至刻度，摇匀作为线性贮备液，再分别移取0.3，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 ml线性贮备液，置入10 ml量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀（相对于样品中杂质含量分别为0.03 %，0.05 %，0.10 %，0.15 %，0.20 %，0.25 %，0.30 %），作为线性溶液。

供试品溶液：称取阿托伐他汀钙样品约50 mg，置入50 ml量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀。

对照溶液：量取1 ml供试品溶液，置入100 ml量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。再量取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀释液稀释至刻度，摇匀。

降解实验溶液：称取阿托伐他汀钙样品7份，每份50 mg，分别置入50 ml量瓶，分别进行酸破坏（加0.5 mol/L盐酸溶液2 ml，放置24 h，加0.5 mol/L氢氧化钠溶液2 ml调pH至中性）、碱破坏（加0.5 mol/L氢氧化钠溶液4 ml，放置 24 h，加0.5 mol/L盐酸溶液4 ml调pH至中性）、氧化破坏（加30 %双氧水4 ml放置14 d）、光照破坏（置于4500±500 Lx下光照40 d）、高温破坏（置于105 ℃放置40 d）、高湿破坏（置相对湿度92.5 %放置40 d）和未进行破坏。取上述样品，分别加稀释液溶解稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液；移取各破坏的供试品溶液1 ml，置入100 ml量瓶，加稀释液定容，摇匀；再移取5 ml，置入50 ml量瓶，加稀释液至刻度，摇匀，作为对照溶液；精密称取阿托伐他汀钙对照品25 mg，置入25 ml量瓶，加稀释液溶解，定容，摇匀，再精密吸取10 ml，置入25 ml量瓶，加稀释液溶解，定容，摇匀，作为含量对照品溶液（用于质量平衡）；精密吸取各破坏的供试品溶液10 ml，置入25 ml量瓶，加稀释液稀释至刻度，作为含量供试品溶液。

2.3 结果

2.3.1 专属性试验取系统适应性溶液和各杂质定位溶液，照2.1项下色谱条件进样分析，结果表明，本色谱条件下，阿托伐他汀钙主峰及各杂质峰间均能达到良好的分离，分离度均在1.5以上（见图1）。

AT：阿托伐他汀钙；IMP：杂质图1 系统适应性图谱注：杂质D和杂质M均出二个色谱峰

2.3.2 线性关系考察取标准曲线溶液，照2.1项下色谱条件进样分析，由质量浓度（μg/ml）对峰面积做线性回归方程并计算其校正因子，具体数据见表2。结果表明，阿托伐他汀钙和各杂质均在0.3～3.0 μg/ml范围内线性良好。

表2 线性数据

2.3.3 检测限和定量限精密移取各杂质定位溶液适量，用稀释液逐级稀释，照2.1项下色谱条件进样分析，按信噪比S/N=10计算定量限，定量限溶液连续6针峰面积RSD均小于10 %，各杂质定量限浓度水平均小于0.03 %（相对于样品中杂质含量）；按信噪比S/N=3计算检测限,各杂质检测限浓度水平均小于0.01 % （相对于样品中杂质含量），结果见表3。

表3 检测限和定量限

2.3.4 回收率试验精密称取杂质A、B、C、D、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P对照品各5 mg，分别置入同一100 ml量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密移取10 ml，置入50 ml量瓶，加稀释液至刻度，摇匀，作为回收率贮备液，精密称取阿托伐他汀钙样品20 mg共12份，分别置入20 ml量瓶，再分别移取0.6，2.0，3.0，6.0 ml回收率贮备液置入20 ml量瓶，共3份，加稀释液稀释至刻度，摇匀（相对于样品中杂质含量分别为0.03 %，0.10 %，0.15 %，0.30 %），作为回收率供试品溶液。照2.1项下色谱条件测定上述12份溶液，计算每个杂质回收率和RSD，结果见表4，各杂质回收率均约100 %，且平行性较好。

表4 回收率试验结果（n=12）

2.3.5 重复性试验称取阿托伐他汀钙样品20 mg，共6份，分别置入20 ml量瓶，再分别移取2.3.4项下回收率贮备液3.0 ml，置入20 ml量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀（相对于样品中杂质含量为0.15 %）作为重复性试验供试品溶液，照2.1项下色谱条件，连续测定6份重复性试验供试品溶液，6份供试品溶液中各杂质含量RSD均小于5.0 %，结果表明，本方法本仪器重复性良好。

2.3.6 精密度试验

2.3.6.1 进样精密度试验照2.1项下色谱条件，连续测定对照溶液6次，按峰面积计算RSD为0.1 %，结果表明，本方法本仪器进样精密度良好。

2.3.6.2 中间精密度试验不同天，由另一名检验员，使用另一台UPLC仪器，按2.3.5项下方法配制6份中间精密度试验溶液，照2.1项下色谱条件，连续测定6份溶液，计算6个溶液中各杂质含量RSD均小于5.0 %。同时计算两名检验员间12份溶液各杂质含量RSD均小于5.0 %。结果表明，本方法中间精密度良好。

2.3.7 供试品溶液稳定性试验称取阿托伐他汀钙样品约50 mg，置入50 ml量瓶，加稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液，于仪器样品室中（10 ℃），分别于0，4，8，12，18，24，32，40，48 h，照2.1项下色谱条件进样分析，试验结果表明，供试品溶液48 h内较稳定（与初始值0 h比较，无新增杂质，无杂质消失，各杂质增减在0.05 %之内）。

2.3.8 耐用性考察根据2.1项下色谱条件，采用不同品牌PFPP UPLC色谱柱、柱温（33，37 ℃）、流速（0.41，0.45 ml/min）、波长（242，246 nm）、流动相A中各组份比（66:22:6:6，68:20:6:6，67:21:5.8:6.2，67:21:6.2:5.8）和流动相B中各组份比（26:62:6:6，28:60:6:6，27:61:5.8:6.2，27:61:6.2:5.8），依次按2.1项下色谱条件进行系统适应性溶液试验。结果表明，不同品牌PFPP UPLC色谱柱保留时间差异较大，如不使用推荐色谱柱，可能造成杂质A、L、B及主峰分离不够；其他参数的微小变化下，各杂质峰间均能达到较好分离，基本不影响检测。上述结果表明除对色谱柱要求较高外，本方法耐用性较好。

2.3.9 降解试验结果照2.1项下色谱条件依次进样降解试验溶液分析，结果见表5。在酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏、光照破坏、高湿破坏等条件下，可检出除杂质A、杂质M、杂质G、杂质I除外的11个已知杂质，且阿托伐他汀钙主峰及检出各杂质峰的峰纯度均符合要求（峰纯度阈值大于峰纯度角值），且质量保持平衡。表明此法专属性好，能有效检测样品中的降解产物。

表5 降解试验数据

2.3.10 样品检测结果对8个批次阿托伐他汀钙样品进行检测，结果见表6，第1～4批次样品均未检出文中研究的15个杂质，均检出未知杂质，杂质总量均在0.1 %左右，第5～8批次样品均检出杂质L，且第6～7批次样品均检出已知杂质F，但上述杂质含量均较低，单个杂质含量均低于0.1 %，杂质总量均低于0.15 %。

表6 8个批次样本检测数据

3 讨论

3.1 UPLC检测方法建立的必要性

检测上述15个已知杂质是各国药典以及相关企业内控质量标准的内在要求。在酸破坏、碱破坏、氧化破坏、高温破坏、光照破坏、高湿破坏等条件下，可检出除杂质A、杂质M、杂质G、杂质K、杂质I的10个已知杂质，上述破坏试验提示：在仓储、运输等过程中均有可能降解产生上述杂质，进而影响产品质量，因此建立简单、便捷、可定量的方法对控制产品质量有重要的实际价值。相较于传统HPLC方法，UPLC方法有分析时间更短、检测灵敏度更高，进样量更小等优势，更适应生产企业高效率检测等需要。

3.2 流动相选择

流动相选择参考了美国和欧洲药典收载流动相体系，并结合本实验室试验结果进行优化选择后最终确定。验证过程中发现，甲醇和四氢呋喃的用量对有些杂质之间分离影响较大，且四氢呋喃对基线梯度影响较大，因此需准确量取甲醇和四氢呋喃。四氢呋喃应不添加稳定剂，如含稳定剂会影响主峰前后的基线，影响杂质A，L，B检出能力及对照溶液主峰峰面积。同时要特别注意密封保存，防止水分及氧化物质进入使四氢呋喃变质，影响检验。