多指标综合评分法优选芩龙降压胶囊的提取工艺

王奎鹏，许红玮，李学林

（河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

芩龙降压方为河南中医学院第一附属医院临床应用多年的有效验方，由龙胆草、黄芩、地龙、白芍、生地和川芎等13味中药组成。全方龙胆草、黄芩共为君药，有清热利湿、活血止痛和解毒的功效[1-3]；臣药地龙、白芍养其阴血，舒肝理气，活血祛瘀，滋阴养肝为主[4]，生地、川芎[5]行其血滞，活血行气，滋肝养肾。全方共奏清热解毒，调理脏腑经络气血阴阳以达降压的作用。药理研究表明[6-8]：龙胆苦苷、黄芩苷、芍药苷、毛蕊花糖苷是龙胆草、黄芩、白芍、生地中主要特征性成分，药理活性显著，且与龙胆草、黄芩、白芍、地黄的功效具有相关性，故本实验以龙胆苦苷、黄芩苷、芍药苷和毛蕊花糖苷含量的综合评分为指标，采用正交试验优选芩龙降压胶囊的水提工艺，为该制剂的工业生产提供实验依据。

1 仪器与材料

Waters e2695高效液相色谱仪，Waters 2998 PDA检测器，Empower色谱工作站；Sartorius CP225D电子天平（北京赛多利斯），Hk250型科导台式超声波清洗器（上海科导），LXJ-ⅡB型低速大容量多管离心机（上海安亭）。

龙胆草、黄芩、白芍、地龙等药材均来源于本院中药饮片库房，经鉴定均符合《中国药典》2015 年版一部相关项下规定；龙胆苦苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：110770～201314）；黄芩苷对照品（中国食品药品检定研究院，供含量测定用，批号：110715～201318）；芍药苷对照品（中国食品药品检定研究院，供鉴别用，批号：110738～201337）；毛蕊花糖苷对照品（四川维克奇，纯度大于98 %）。甲醇、乙腈、磷酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。芩龙降压胶囊提取液：以龙胆苦肝、黄芩苷、芍药苷和毛蕊花糖苷质量分数为综合评价指标，按L9(34)正交表进行加热回流得到正交试验提取液。

2 方法与结果

2.1 龙胆苦苷的含量测定[9]

2.1.1 色谱条件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱，流动相乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91，v/v），检测波长270 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl。理论塔板数按龙胆苦苷峰计算不低于3000，见图1。

2.1.2 对照品溶液的制备 精密称取龙胆苦苷对照品5.01 mg，置入25 ml棕色量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.3 供试品溶液的制备 精密量取正交试验提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇约9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

图1 芩龙降压胶囊提取液中龙胆苦苷HPLC图谱

2.1.4 线性关系考察 按上述色谱条件分别进样1，2，3，4，5和6 μL测定，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得回归方程Y=56 100X-33 500（r=0.9999），线性范围0.2004～1.2024 μg。

2.2 黄芩苷的含量测定[10]

2.2.1 色谱条件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱，流动相：以乙腈-0.1 %磷酸水溶液（21:79，v/v），检测波长280 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl。理论板数按黄芩苷峰计算不低于3000，见图3。

图 2 芩龙降压胶囊提取液中黄芩苷HPLC图谱

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取黄芩苷对照品5.46 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 精密量取正交试验提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇约9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.2.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液1，2，4，6，8，10，12 ml，分别置入10 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得回归方程Y=3 185 782X-242 551（r=0.9999），线性范围0.1092～1.3104 μg。

2.3 芍药苷的含量测定[9]

2.3.1 色谱条件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱，乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91，v/v），检测波长230 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl。理论板数按芍药苷峰计算不低于3000，见图2。

图3 芩龙降压胶囊提取液中芍药苷HPLC图谱

2.3.2 对照品溶液的制备 精密称取芍药苷对照品5.06 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备 精密量取正交试验提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过，即得。

2.3.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液 1，2，3，5，7，9 μl，分别置入25 ml量瓶，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得回归方程Y=1 131 538X+22 645（r=0.9998），线性范围0.2024～1.8216 μg。

2.4 毛蕊花糖苷的含量测定[11]

2.4.1 色谱条件 ZORBAXSB-Aq（4.6 mm×250 mm, 5 μm）色谱柱，流动相：以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，0～30 min（16:84，v/v），30～50 min（21:79，v/v），检测波长334 nm，流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，进样量10 μl。理论板数按毛蕊花糖苷峰计算不低于3000，见图4。

图 4 芩龙降压胶囊提取液中毛蕊花糖苷HPLC图谱

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品5.23 mg，置入25 ml量瓶，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.4.3 供试品溶液的制备 精密量取正交试验提取液10 ml，置入25 ml棕色量瓶，加入甲醇约9 ml溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀，经0.45 μm 微孔滤膜滤过，即得。

2.4.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液 1，2，3，5，7，10 ml，分别置入10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，得回归方程Y=60 422 678X-232.30（r=0.9999），线性范围 0.02092～0.2092 μg。

2.5 提取工艺优选

选择加水量、提取次数及提取时间为考察因素，以龙胆苦肝、黄芩苷、芍药苷和毛蕊花糖苷质量分数（W）为综合评价指标，按处方量称取各药材，共9份，置平底烧瓶中，按L9(34)正交表进行加热回流提取。因素水平见表1。为客观反映各因素间的关系及因素水平对水提液质量的影响，拟采用综合加权评分法进行数据处理。试验安排及结果见表2，方差分析见表3。

表 1 正交试验因素水平

表 2 正交试验安排及结果/mg·g-1

表 3 综合评分方差分析

由表3极差R值可见，各因素作用主次为C（提取次数）＞B（提取时间）＞A（加水量）。表3方差分析结果表明，C因素各水平之间有显著性差异（P＞0.05），B因素各水平之间具有差异（0.05＜P＜0.1），A 因素各水平之间无显著性差异（P＞0.05），综上所述，最终提取工艺确定为：A1B3C3，8倍量水，提取3次，每次2 h。

本实验对本处方中君药和臣药中的有效成分含量数据采用综合加权评分法[12]处理，综合指标（overall desirability，OD）的计算公式为：

OD=0.3×W1/Wmax1×100+0.3×W2/Wmax2×100+0.2×W3/Wmax3×100+0.2×W4/Wmax4

其中Wn为正交试验提取液量，Wmax为正交试验提取液量最大值。

2.6 验证试验

称取处方量药材共3份，每份125 g，按最佳提取工艺进行验证试验，计算提取物中龙胆苦苷、黄芩苷、芍药苷、毛蕊花糖苷质量分数分别为10.03 %，12.88 %， 1.55 %，0.78 %。RSD分别为1.12 %，0.62 %， 1.47 %，1.83 %，表明优选的提取工艺条件稳定可行。

3 讨论

3.1 本处方中药成分多，具有多组分、多靶点的作用特点。本实验对本处方中君药和臣药中的有效成分含量数据以OD综合考察各个指标，以综合指标进行直观分析各因素间的关系及因素水平对水提液质量的影响。据指标因素对水提工艺影响的贡献差异给予分配不同的权重系数，即龙胆苦肝的含有量为0.3，黄芩苷的含有量为0.3，芍药苷的含有量为0.2，芍药苷的含有量为0.2，再进行加权求和，按下式综合评分，以综合评分为考察指标，优选最佳中药复方提取工艺。

3.2 中药成分复杂，复方中极性相似成分众多。按2015 年版《中国药典》相关项下条件测定发现，龙胆苦苷、黄芩苷、芍药苷、毛蕊花糖苷目标峰均受到干扰，通过调整流动相比例，最终将龙胆苦苷、芍药苷流动相调为：乙腈-0.1 %磷酸水溶液（9:91），黄芩苷流动相调为：乙腈-0.1 % 磷酸水溶液（21:79）；毛蕊花糖苷流动相调为：以乙腈-0.1%磷酸水溶液进行梯度洗脱，0～30 min（16:84，v/v），30～50 min（21:79，v/v）；流速1.0 ml/min，柱温30 ℃，检测波长依次为270，230，280，334 nm，分离度明显改善。

3.3 本制剂以汤剂形式在我院临床应用多年，临床效果较好，但是传统煎煮法会造成龙胆草、黄芩等有效成分提取率低、提取不完全甚至有效成分被破坏等缺点，因此，本实验以该制剂中龙胆苦苷、黄芩苷、芍药苷、毛蕊花糖苷作为提取评价指标，实现了多成分、多靶点综合控制该制剂的质量。该工艺稳定可靠，含量测定方法操作简单，重复性好，对进一步提高该制剂的临床疗效和合理用药有一定的指导意义。