人参多糖3种给药途径大鼠体内药动学特征比较

房绍英，马 河，侯重文，邵华荣，程艳玲

（山东省药学科学院，山东 济南 250101）

人参（Ginseng radix et rhizoma）为五加科多年生草本植物人参（Panax ginsengC. A. Mey.）的根，是我国传统名贵中药。人参多糖为人参的主要活性成分之一，具有免疫调节[1]、降血糖[2]、抗氧化[3]等多方面药理作用。近年对人参多糖的研究热点主要涉及分离纯化、功能活性评价和作用机制探讨[4-7]，药动学特征则未见报道。目前国内仅有肌肉注射的人参多糖注射液上市，其他给药途径剂型有待开发。本课题组前期采用生晒参提取获得人参多糖，经指纹图谱鉴定其组成包括半乳糖醛酸、葡萄糖（S）、半乳糖、阿拉伯糖及鼠李糖；多糖重均分子量为2705，分子量分散系数1.69。本试验研究人参多糖静脉注射、肌肉注射及口服3种给药途径在SD大鼠体内的药动学特征，计算肌注途径和口服途径的生物利用度，为后期人参多糖的临床应用开发提供参考依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；AUW-120D型电子分析天平（日本岛津公司）；MS3型漩涡混悬器（德国IKA公司）；Thermo Sorvall 21R高速微量冷冻离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；Milli-Q Advantage A10超纯水仪（德国默克公司）；ACS-JJ-Tiger电子计价秤（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 药品与试剂

人参多糖（山东省药学科学院，批号：20160501，含量：94.27 %）；二水合磷酸二氢钠（国药集团，批号：20160106）；高氯酸（天津鑫源化工，批号：20150905，含量：70.0 %～72.0 %）；肝素钠注射液（山东鲁抗辰欣药业公司，批号：1609286421）；水为超纯水。

1.3 实验动物及饲养环境

SPF级SD大鼠18只，雌雄各半，体重范围230～260 g。由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鲁）2014 0007。饲养条件：SD大鼠于SPF级环境饲养，每笼5只。室温19～26 ℃，湿度40 %～70 %，日温差≤4 ℃，换气次数8～10次/h，昼夜明暗交替时间12 h/12 h，实验动物使用许可证号：SYXK（鲁）2014 0008。

2 方法

2.1 动物给药与样品采集

18只SD大鼠按体重随机分成3组，每组6只，雌雄各半。禁食约12 h后，分别静脉注射、肌肉注射、口服给予600 mg/kg人参多糖（以半乳糖醛酸计）。各组药前采血，静脉注射组于药后0.083，0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，肌肉注射组于药后0.25，0.5，1，2，4，6，8 h，口服组于灌胃给药后0.5，1，2，4，6，8 h采血约0.5 ml，置于肝素钠抗凝的离心管中经4 ℃，12 000 r/min离心10 min，制备血浆，-20 ℃冷冻保存待测。

2.2 生物样本测试

色谱柱：TSK-GEL G3000PWXL（7.8 mm×300 mm，5 µm），流动相：0.05 mol/L NaH2PO4，流速：0.6 ml/min，柱温：35 ℃，检测器：RID-20AT示差折光检测器，检测池温度：40 ℃，进样体积：20 µl。样本处理：取血浆样品100 µl置于1.5 ml离心管中，加入2 mol/L高氯酸溶液50 µl，涡旋2 min后11 000 r/min离心10 min，取上清，进样检测。

2.3 统计学处理

根据各组别人参多糖血药浓度-时间数据，利用DAS3.2.6药动学程序计算半衰期（t1/2）、达峰时间（Tmax）、表观分布容积（Vd）、清除率（CL）、达峰浓度（Cmax）、平均滞留时间（MRT）、药时曲线下面积（AUC0-t、AUC0-∞）等，并利用SPSS16.0对主要药动学参数进行统计学分析。与静脉注射AUC0-t比较，计算肌肉注射和口服给药途径的绝对生物利用度。

3 结果

3.1 样本测试方法考察

大鼠空白血浆色谱图及实际测试血浆样本色谱图见图1。由表1可见，在该分析条件下空白SD大鼠血浆中的内源性物质不干扰人参多糖的测定。人参多糖的保留时间约11.8 min。

图1 大鼠空白血浆色谱图（A）及大鼠静脉注射给予人参多糖注射液后血浆样本色谱图（B）

表1 静注组、肌注组人参多糖药动学参数

该方法在25～800 mg/L范围内线性良好（Y=211.850X-4193.44，r2=0.9929），定量下限为25 mg/L（5平行样本分析，RSD为3.84 %，RE为14.75 %）。在高、中、低3个浓度下，回收率分别为78.35 %±7.85 %，84.25 %±5.23 %，80.86 %±5.4 %，RSD小于10.02 %。在高、中、低3个浓度下考察3批次精密度与准确度，人参多糖在每一浓度水平的批内精密度（RSD）小于3.95 %，相对误差（RE）为-13.39 %～5.00 %；批间精密度（RSD）小于8.24 %，相对误差（RE）为-11.62 %～-2.30 %。在低、高2个浓度下，人参多糖血浆样本3次冻融稳定性RE分别为102.12 %±6.76 %，90 %±5.31 %，RSD小于6.62 %；-2 0 ℃冻存7 d稳定性R E分别为9 8.4 6 %±9.67 %，105.46 %±4.92 %，RSD小于9.82 %。

3.2 人参多糖药动学研究结果

静注组、肌注组SD大鼠分别静脉注射、肌肉注射600 mg/kg人参多糖后，绘制平均血药浓度-时间曲线图（见图2）；人参多糖主要药动学参数见表1。口服组SD大鼠灌胃给予600 mg/kg人参多糖后，血药浓度均低于检测限，未被检出。静注组与肌注组相比，t1/2z差异无统计学意义（P＞0.05）；Vd、MRT和CL均低于肌注组（P＜0.01）；同时Cmax和AUC0-8h均明显高于肌注组（P＜0.01）。根据肌注组及静注组AUC0-8h平均值计算肌肉注射方式的绝对生物利用度为27.46 %。

图2 静注组（A）及肌注组（B）SD大鼠分别给予600 mg/kg人参多糖注射液后平均血药浓度-时间曲线（n=6）

4 讨论

药动学研究的前提是建立灵敏可靠的药物分析方法。多糖类药物结构的特殊性及生物体内大量内源性相似多糖的干扰，使该类药物的分析方法不同于传统的化学药品，检测难度大、需解决的问题多。目前用于多糖类药物的血药浓度检测方法主要有以下几种：同位素标记示踪法[8]、生物检定法[9]、色谱法[10]、荧光标记[11]等。多糖类药物无紫外吸收基团和荧光发射基团，质谱法也不适用于多糖的检测。本研究采用分子排阻色谱法联合示差折光检测器，建立了有效可靠的分析方法，该方法样本处理简单，重复性良好，准确率高，为后续人参多糖药动学研究提供良好支持，但此分析方法仍有其应用的局限性，由于示差折光检测器检测灵敏度低，此方法的检测限尚不能满足口服途径人参多糖在大鼠体内的药动学研究。

分子排阻色谱法的分离原理为凝胶色谱柱的分子筛机制，血浆样本存在大量内源性多糖，因此色谱分离容易存在内源性干扰，样本处理方法是影响色谱分离效果的重要因素。本试验分析方法建立时，对人参多糖血浆样本的处理方法进行了反复摸索，尝试了不同浓度硫酸铵、乙酸锌和高氯酸等多种蛋白质沉淀方法，最终选择2 mol/L高氯酸溶液涡旋沉淀去除蛋白质，此方法人参多糖回收率在78 %以上，且色谱峰无内源性干扰。

本试验初期参考人参多糖注射液临床使用剂量，根据体表面积折算为大鼠给药剂量，但给药后血药浓度均无法检出，故提高多倍剂量并参考毒理试验剂量，最终拟定给药剂量为600 mg/kg。该剂量下，静脉注射组峰浓度可达4000 mg/L以上，而口服组峰浓度低于25 mg/L，不足静注组的0.625 %，其原因可能由于人参多糖原型难吸收或在消化道内被降解，使药物浓度低于本方法的检测限而无法检出。比较肌肉注射组和静脉注射组药动学参数，t1/2无明显差异，静注途径Vd、MRT和CL低于肌注组，Cmax和AUC0-8h均明显高于肌注组。结果显示，肌肉注射人参多糖在体内分布更广，存留时间更长，但肌肉注射的生物利用度较低，吸收进入体循环的药物相对量仅为27.46 %，且本课题组相关药效学试验发现，人参多糖肌肉注射途径存在明显肌肉刺激性。本研究提示人参多糖开发为静脉注射剂型具有优越性。