柱前衍生化HPLC测定盐酸阿比多尔颗粒中有关物质二甲胺

王立立，张 云，张相军

（山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101）

盐酸阿比多尔有干扰素作用，通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒复制，对具有A、B型抗原的流感病毒的抗病毒活性最显著；除具有杀灭病毒作用外，还有免疫调节作用，激活吞噬细胞，提高机体对病毒的抵抗能力；是用于治疗A、B型病毒引起的流感和急性呼吸道病毒性感染的新型抗病毒药物[1-3]。

二甲胺是盐酸阿比多尔的合成原料，在体内易与亚硝酸根反应形成致癌性的N-亚硝基胺毒性物质，从而对人体健康造成危害[4-6]。为了保证药品安全性，有必要对盐酸阿比多尔颗粒中的潜在杂质二甲胺进行控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1260）；Mettler Toledo XS205电子分析天平（梅特勒-托利多）；DKB-2006低温恒温槽（上海精宏）；TGL-16gR离心机（上海安亭）。

1.2 试药

盐酸二甲胺对照品（批号：H1527047，纯度＞99.0 %），2,4-二硝基氟苯（批号：20160702，梯希爱，纯度＞99.0 %）均购自阿拉丁；盐酸阿比多尔颗粒（批号：160928、161102、170416，石家庄四药）；三乙胺（批号：20160203，国药集团化学试剂公司）；乙腈为色谱纯，磷酸为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Pinnacie DB C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1 %磷酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长：380 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 衍生试剂 精密量取1 ml 2,4-二硝基氟苯置入100 ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，临用现配。

2.2.2 二甲胺对照溶液 取盐酸二甲胺对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度为5 μg/ml（以二甲胺计）二甲胺对照品贮备液。精密量取该贮备液1 ml至10 ml量瓶，加入100 μl三乙胺和1 ml生试剂，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度，摇匀，过滤，作为二甲胺对照溶液和系统适用性溶液。

2.2.3 供试品溶液 精密称取盐酸阿比多尔粉末适量（约相当于盐酸阿比多尔10 mg），置入10 ml量瓶，加5 ml乙腈，超声10 min后，加入100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度，摇匀，过滤。

2.2.4 空白溶液 分别精密量取5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂至10 ml量瓶中，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度。

2.3 方法学考察

2.3.1 系统适应性 分别取2.2项下空白溶液，对照溶液和供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样，二甲胺衍生物峰与距离最近的衍生试剂所产生的峰分离度大于1.5，理论塔板数以二甲胺衍生物计算不低于3000，满足定量要求。见图1。

图1 盐酸阿比多尔颗粒色谱图

2.3.2 定量限 精密量取二甲胺对照品贮备液60 μl置入10 ml量瓶，依次加入5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀后，60 ℃加热30 min，冷却后用乙腈定容至刻度，摇匀，进样。按S/N=10计算定量限为0.30 ng。

2.3.3 线性关系的考察 取二甲胺对照品贮备液依次稀释，获得二甲胺浓度分别为0.03，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 μg/ml系列对照品溶液，按2.2项下对照溶液制备方法，2.1项下色谱条件，分别进样，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，以对照溶液的浓度X（μg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=167.59X- 0.4745，r=0.9999。

2.3.4 精密度试验 取2.2.2项下对照溶液，按2.1项下色谱条件，连续进样6次，记录峰面积，二甲胺峰面积的RSD为0.6 %（n=6），结果表明方法精密度良好。

2.3.5 重复性试验 按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件进行测定，记录峰面积，计算二甲胺的含量平均值为0.023 %，RSD为1.3 %（n=6）。

2.3.6 中间精密度试验 由不同实验人员采用相同操作方法，使用两台不同的高效液相色谱仪，重复上述重复性项下试验，仪器A（Agilent 1260）、B（岛津20A）测得二甲胺的含量平均值为0.025 %，RSD为3.1 %（n=12）。

2.3.7 耐用性试验 通过改变流动相初始比例、0.1 %磷酸溶液的浓度、流速、柱温、波长、不同品牌的色谱柱等参数的变化，系统适用性溶液的分离度均大于5.0，表明该方法的耐用性良好。

2.3.8 加样回收率试验 取批号为160928的供试品，精密称定（约相当于盐酸阿比朵尔10 mg），共9份，置入10 ml量瓶，分别加入乙腈5 ml，超声10 min，每个量瓶中依次加入对照溶液0.8，1，1.2 ml各3份，分别加100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀后，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容。取续滤液进样，计算加样回收率。结果见表2。

表2 样品测定结果

2.4 样品含量测定 取本品3批（批号：160928、161102、170416），按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件进样测定，记录色谱图，3批样品中二甲胺的含量分别为：0.023 %，0.021 %，0.025 %。

3 讨论

3.1 衍生条件选择 本试验验证了不同的水浴温度（50，60，70 ℃），不同的衍生时间（20，30，40 min），不同的三乙胺体积（80，100，120 μl）对衍生结果的影响，最后确定水浴温度为60 ℃时，加入100 μl三乙胺反应30 min最合适。

3.2 本文制定的柱前衍生化-HPLC能准确地测定盐酸阿比朵尔中二甲胺的含量，方法简便，重现性好，为制剂的质量可控性提供了科学的检验方法。