HPLC测定清热明目丸中绿原酸、柚皮苷、黄芩苷的含量

丁晓爽，李 惠*

（淄博市食品药品检验研究院，山东 淄博 255086）

外障眼病是临床中常见的眼科疾病，易复发，其中结膜炎、角膜炎和沙眼为前3位外障眼病，现代医学使用抗生素或激素类药物的临床效果并不理想，而中医治疗在古人经验的基础上治疗外障眼病具有一定优势。

清热明目丸由金银花、大青叶、麸炒枳壳、夏枯草、黄芩、菊花等14味药制成，祛风清热，退翳明目，可用于异物感、羞明流泪、目赤生翳等外障眼病。为控制制剂质量，确保其临床应用安全有效，本文采用高效液相色谱法（HPLC）梯度洗脱方式对金银花、菊花、麸炒枳壳、黄芩中的主要有效成分绿原酸、柚皮苷、黄芩苷进行定量测定。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津）；CP225D电子分析天平（北京赛多利斯）；KS-300EI超声波清洗机（宁波海曙科生）。

1.2 试药

绿原酸对照品（批号110753-201415，含量96.2 %）、柚皮苷对照品（批号110722-201613，含量94.3 %）、黄芩苷对照品（批号110715-201318，含量93.3 %）（中国食品药品检定研究院），清热明目丸（淄博市中医医院，批号170407、170412、170418，规格：每瓶装60 g），乙腈、甲醇均为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：以乙腈为流动相A，0.4 %磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长：283 nm；柱温40 ℃；流速：1.0 ml/min；进样体积：10 μl。

表1 梯度洗脱表

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取绿原酸对照品适量，精密称定，加50 %甲醇制成每1 ml含绿原酸0.1937 mg绿原酸对照品溶液；取柚皮苷对照品适量，精密称定，加50 %甲醇制成每1 ml含柚皮苷0.2056 mg柚皮苷对照品溶液；取黄芩苷对照品适量，精密称定，加50%甲醇制成每1 ml含黄芩苷0.3682 mg的黄芩苷对照品溶液。

2.2.2 混合对照品溶液的制备 分别精密量取绿原酸对照品溶液2 ml，柚皮苷对照品溶液1 ml，黄芩苷对照品溶液1 ml，置同一10 ml量瓶，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取本品适量，研细，取约2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，称定重量，超声处理（功率300 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用50 %甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液5 ml，置入25 ml棕色量瓶，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备 取处方中去除金银花、菊花、黄芩、麸炒枳壳外的其他药材，按清热明目丸处方比例和工艺制备阴性对照药丸，按2.2.3项下方法，制备阴性对照溶液。

2.3 专属性及耐用性试验

2.3.1 专属性试验 分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1。供试品溶液的色谱图中，在与对照品溶液的色谱图相应的位置上，有相同保留时间的色谱峰，且阴性无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.3.2 耐用性试验 取2.2.3项下同一供试品溶液，按2.1项下色谱条件，用Agilent Eclipse XDB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、岛津Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）两种色谱柱试验，各主峰的理论板数均不低于2000，各主峰之间及各主峰与相邻杂质峰之间分离度均良好。

2.4 线性关系考察

分别精密量取2.2.1项下绿原酸对照品溶液0.2，0.4，1.0，2.0，4.0 ml；柚皮苷对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0 ml；黄芩苷对照品溶液0.1，0.2，0.5，1.0、2.0 ml，对应加入20，20，10，10，10 ml量瓶，加50 %甲醇稀释至刻度，摇匀。分别精密吸取上述不同浓度的混合对照品溶液各10 μl，注入液相色谱仪，记录峰面积。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，得绿原酸回归方程Y=2×107X-9613，r=0.9998；柚皮苷回归方程Y=2×107X+1576，r=0.9999；黄芩苷回归方程Y=3×107X+336，r=0.9999。表明绿原酸、柚皮苷、黄芩苷分别在浓度为1.937～77.48，1.028～41.12，1.841～73.64 μg/ml范围内与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取2.2.2项下的混合对照品溶液10 μl，连续进样6次，记录色谱图，测得绿原酸、柚皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.12 %，0.45 %，0.16 %（n=6）。表明仪器精密度较好。

2.6 重复性试验

取同批号（170418）的样品6份，精密称定，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μl注入液相色谱仪进行测定，测得绿原酸、柚皮苷、黄芩苷的平均含量分别为4.8522，2.1754，4.7973 mg/g，RSD分别为1.01 %，1.65 %，0.76 %（n=6），结果表明，本法具有较好的重复性。

2.7 稳定性试验

取2.2.3项下制备的供试品溶液，分别于配制后在室温下放置0，4，8，12，18，24 h各精密吸取10 μl注入液相色谱仪进行测定，测得绿原酸、柚皮苷、黄芩苷峰面积的RSD分别为0.79 %，0.70 %，1.36 %。结果说明，供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.8 加样回收试验

取已知含量样品（批号170418）9份，各约1.0 g，精密称定，分别按样品含量的50 %，100 %，150 %加入绿原酸、柚皮苷和黄芩苷对照品，按2.2.3项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取10 μl注入液相色谱仪进行测定，测得绿原酸、柚皮苷、黄芩苷的平均加样回收率分别为98.6 %，98.6 %，99.1 %，RSD分别为1.6 %，1.2 %，1.2 %（n=9），详见表2～表4。

表2 绿原酸加样回收率试验

表3 柚皮苷加样回收率试验

表4 黄芩苷加样回收率试验

2.9 样品测定

取清热明目丸3批（批号170407，170412，170418），按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定样品中绿原酸、柚皮苷、黄芩苷的含量，结果见表5。

表5 样品测定结果

3 讨论

对于用药分类而言，外障眼病的治疗方法多以补气血，通腑泄热，清热泻火为常法，清热明目丸处方中金银花可清热解毒；菊花可祛风清热[1]，两者均含有绿原酸，具有抗炎、抑菌、抗病毒等作用[2]，麸炒枳壳可疏通气机，其主要成分柚皮苷有显著镇痛抗炎效果[3]，黄芩是外障眼病方剂中使用频次较高的药物，清肝明目、疏风清热[4]，其主要有效成分黄芩苷具有抗菌、抗炎、抗过敏等作用[5]，它们对制剂疗效至关重要，因此对其含量进行检测，以保证制剂质量。

由文献[6]可知，绿原酸、柚皮苷、黄芩苷分别在327，283，280 nm处有最大吸收，为使3种成分同时有较好的检出灵敏度，分别在3个波长下将混合对照品溶液注入液相色谱仪测定，发现在327和280 nm下，柚皮苷峰的灵敏度较低，通过考虑样品中3组份的含量，并且参照文献[7-8]，最终选择283 nm作为本次实验的检测波长。

在流动相的选择上，通过查阅文献[9-11]，考虑同时测定绿原酸、柚皮苷和黄芩苷的含量，分别对不同流动相、不同比例、不同洗脱方式等多方面进行筛选，最终确定了在该条件下测定3者含量，其分离效果好，基线平稳，达到了预定含量测定的目的。

本方法能同时测定绿原酸、柚皮苷、黄芩苷，兼具准确度高、检测线性范围广、方法重复性良好，并且能省时、省力、节约成本，可用于清热明目丸的质量控制。