左、右半结肠癌在微卫星不稳定性、K-ras基因突变以及其他临床病理特征方面的差异

陈朝旭 马 欢 战淑慧

青岛大学医学部附属青岛市市立医院东院消化内科(266011)

背景：结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，左、右半结肠癌的发生机制、生物学行为、基因表达等方面存在明显差异。目的：探讨左、右半结肠癌在临床病理特征、微卫星不稳定性(MSI)、K-ras基因突变等方面的差异。方法：收集2017年6月—2018年6月青岛市市立医院收治的144例术后病理检查确诊为结肠癌患者的资料，采用免疫组化法评估MSI，PCR法检测K-ras基因突变情况。分析左半结肠癌、右半结肠癌的临床病理特征、MSI、K-ras基因突变等的差异。结果：右半结肠癌好发于女性，左半结肠癌好发于男性。右半结肠癌的淋巴结转移、CEA阳性率、MSI发生率明显高于左半结肠癌(P<0.01)，而K-ras基因突变率显著低于左半结肠癌(P<0.05)。左半结肠癌K-ras基因突变与患者性别、淋巴结转移和CEA阳性率有关(P<0.05)；右半结肠癌MSI与患者性别、年龄和淋巴结转移有关(P<0.05)。结论：左半结肠癌与右半结肠癌的MSI和K-ras基因突变存在不同程度的差异，可为结肠癌的诊断、个体化治疗、预后提供依据。

结直肠癌是消化系统常见的恶性肿瘤之一，目前其发病率在恶性肿瘤中位居第三位，病死率位居第四位[1]。近年随着我国经济的迅速发展，普通人群的饮食结构发生了巨大变化，结直肠癌发病率和病死率均明显上升。据2015年中国国家肿瘤登记中心(NCCR)的调查数据显示，我国结直肠癌发病率在恶性肿瘤中位居第三位，病死率位居第五位[2]。以结肠脾曲为界，一般将结肠分为右半结肠和左半结肠，其中右半结肠包括回盲部、升结肠、横结肠，左半结肠包括降结肠、乙状结肠，部分学者将直肠归为左半结肠。由于左半结肠、右半结肠的胚胎起源和生物学行为的不同，目前已普遍接受左半结肠癌、右半结肠癌是两种不同疾病的概念[3]。此外，左半结肠癌、右半结肠癌的微卫星不稳定性(microsatellite instability, MSI)、K-ras基因表达存等在不同，影响了肿瘤对化疗药物、靶向药物的反应性[4]，标志着结肠癌进入了个体化治疗的新时代。本研究通过对左半结肠癌、右半结肠癌患者MSI、K-ras基因突变以及临床病理特征的差异进行分析，旨在探讨两者的差异，从而为结直肠癌的个体化治疗提供一定的理论依据。

材料与方法

一、资料来源

选取2017年6月—2018年6月青岛市市立医院收治的144例接受手术治疗且术后病理检查确诊为结肠癌的患者，左、右半结肠癌各72例。所有患者均为初治，术前未接受过放、化疗，且不合并其他部位肿瘤。本研究方案通过青岛市市立医院伦理委员会审批。

二、研究方法

1. MSI的检测：采用免疫组化SP法检测错配修复蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2表达，鼠单克隆抗体购于罗氏公司，免疫组化试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司。实验步骤按照试剂盒说明书进行操作，组织以甲醛固定、石蜡包埋，再经脱石蜡、抗原修复，分别加入抗MLH1(工作浓度1∶150)、抗MSH2(工作浓度1∶100)、抗MSH6(工作浓度1∶150)、抗PMS2(工作浓度1∶150)单抗，36 ℃孵育16 min，苏木精复染4 min，靛蓝试剂再次复染4 min。以正常细胞染色为对照，当细胞核内出现棕色或褐色颗粒时判定为MLH1、MSH2、MSH6、PMS2阳性细胞(图1)。当四种蛋白均为阳性表达时则判定为微卫星稳定(MSS)，四项中任一项为阴性则为MSI。

2. PCR-荧光探针法检测K-ras基因突变情况：提取组织DNA(QIAamp DNA FFPE Tissue Kit购自QIAGEN)，以分光光度计检测DNA浓度，计算A260 nm/A280 nm比值，随后行PCR扩增(试剂盒购自北京鑫诺美迪基因检测技术有限公司)。扩增条件：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，60 ℃退火、延伸35 s，共45个循环。当ΔCt值<8，判定为K-ras基因发生突变。

3. CEA的检测：清晨取患者空腹血2～3 mL，离心，采用化学免疫分析法测定血清CEA水平，具体步骤按照罗氏公司试剂盒说明书操作。

三、统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件，计数资料率的比较采用χ2检验或Fisher精确检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、一般资料

72例右半结肠癌患者中，男性27例，女性45例，年龄31～88岁，平均67.2岁；72例左半结肠癌中，男性48例，女性24例，年龄44～84岁，平均64.3岁。

144例结肠癌患者中，65例(45.1%)CEA阳性，37例(25.7%)发生MSI，74例(51.4%)发生K-ras基因突变。

二、左、右半结肠癌的差异

左半结肠癌与右半结肠癌在性别、淋巴结转移、CEA阳性率、MSI、K-ras基因突变等方面相比差异有统计学意义(P<0.05)，即右半结肠癌好发于女性，更易发生淋巴结转移，CEA阳性率、MSI发生率更高，左半结肠癌K-ras基因突变率更高；而左半结肠癌、右半结肠癌患者的年龄、病理类型、浸润深度、脉管浸润、神经浸润等方面相比差异无统计学意义(P>0.05)(表1)。

图1 细胞核中出现褐色颗粒(免疫组化法，×400)

表1 左半结肠癌、右半结肠癌的临床病理特征、MSI、K-ras基因突变情况比较 n(%)

三、左半结肠癌K-ras基因突变与临床病理特征的关系

在左半结肠癌中，K-ras基因突变与患者性别、淋巴结转移和CEA阳性率有关，差异均有统计学意义(P<0.05)，而与年龄、病理类型、浸润深度、脉管浸润、神经浸润均无关(P>0.05)(表2)。

四、右半结肠癌MSI与临床病理特征的关系

在右半结肠癌中，MSI与患者性别、年龄、淋巴结转移有关，差异均有统计学意义(P<0.05)，而与病理类型、浸润深度、脉管浸润、神经浸润和CEA阳性率均无关(P>0.05)(表2)。

讨 论

结直肠癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发生、发展是基因、环境等因素共同作用的结果，其中基因因素如癌基因、抑癌基因等突变在结直肠癌的发生中起有至关重要的作用。目前，结直肠癌的发生机制仍未完全明确，RAS/RAF/MAPK、PI3K/AKT等由表皮生长因子受体(EGFR)介导的下游信号转导通路持续激活导致肿瘤发生的观点已得到广泛认可[5]，其中K-ras基因突变被认为是结直肠癌发生的早期标志。K-ras基因是RAS家族的重要成员，亦是EGFR通路中最易突变的基因，在肺癌、结直肠癌、胰腺癌等恶性肿瘤的发生、发展过程中起重要作用。K-ras基因可编码具有GTP酶活性的RAS蛋白，当K-ras基因发生突变时，RAS蛋白的结构发生变化，GTP酶活性下降，使EGFR通路异常活化，细胞处于持续增殖状态，最终导致肿瘤的发生[6-8]。K-ras突变型已成为潜在的肿瘤标志物以及精准治疗的靶点[9]。目前，EGFR药物西妥昔单抗和帕尼单抗已用于结直肠癌的治疗，但仅K-ras野生型患者才能从EGFR治疗中获益[9-10]。2015年美国国立综合癌症网络(NCCN)指南亦建议，结直肠癌患者接受靶向治疗前需行全RAS基因(包括K-ras、N-ras)检测[11]。因此，K-ras基因检测有望使结直肠癌患者的精准治疗成为可能。

除上述基因途径外，MSI途径亦是引发结直肠癌的重要机制，该途径于1993年首次在遗传性非息肉病性结直肠癌(hereditary non-polyposis colorectal cancer, HNPCC)中发现[12]。微卫星是基因组中具有高度特异性的短串联重复序列，当错配修复基因(MMR)发生突变或启动子区甲基化时，引起MMR系统功能降低或丧失，使重复序列插入或缺失不能被纠正，导致微卫星的长度发生改变，造成MSI，细胞失去正常调控功能，进一步引起遗传物质的不稳定性，或使癌基因、抑癌基因突变迅速积累，造成细胞增殖失控，从而引起肿瘤的发生。目前主要采用PCR和免疫组化法检测MSI，这两种检测方法无明显差异。有研究指出，对5个微卫星位点(BAT25、BAT26、D2S123、D5S346、D17S250)行PCR检测，2个或以上位点出现不稳定则定义为高度微卫星不稳定(MSI-H)，1个位点不稳定则定义为低度微卫星不稳定(MSI-L)，无位点不稳定则视为MSS[13]。有研究[14]发现，MSI-H的结直肠癌患者不能从氟尿嘧啶治疗中获益。NCCN指南亦指出，对Ⅱ期结肠癌患者给予氟尿嘧啶单药化疗前，需行MSI检测。目前美国食品与药品管理局(FDA)已批准程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1, PD-1)抑制剂用于治疗MSI-H的晚期实体肿瘤患者，为MSI型结直肠癌患者带来了治疗的新曙光。

表2 左半结肠癌K-ras突变、右半结肠癌MSI与患者临床病理特征的关系 n(%)

本研究对左半结肠癌、右半结肠癌患者的临床病理特征、K-ras基因突变和MSI进行分析发现，右半结肠癌好发于女性，而左半结肠癌好发于男性。有研究认为，右半结肠中胆汁酸代谢酶7α-羟化酶的浓度较高，雌性激素能促进肝脏对胆固醇的代谢[15]，使胆固醇、胆汁酸及其代谢产物次级胆汁酸(主要为石胆酸和脱氧胆酸)进入肠道，这些物质尤其是次级胆汁酸具有很强的致癌作用，因此女性更易发生右半结肠癌。而男性的不良生活习惯如酗酒、吸烟、低纤维素饮食等可能是其左半结肠癌患病率高的原因[16-17]。从解剖部位来看，右半结肠血管、淋巴管较左半结肠更丰富，因此更易发生转移，为右半结肠癌发生淋巴结转移提供了解剖学基础。多项研究[18-20]证实，在病理类型方面，右半结肠癌以黏液腺癌、印戒细胞癌多见，且分期晚，分化程度较低。但本研究未发现此现象，可能与印戒细胞癌、黏液腺癌的发病率较低有关，未来还需行多中心大样本研究进一步证实。本研究发现，右半结肠癌CEA阳性率高于左半结肠癌。有研究证实CEA与TNM分期具有相关性[21]，且右半结肠癌具有分期差、血管淋巴转移率高等特点，导致右半结肠癌的CEA阳性率高于左半结肠癌。

本研究发现，结肠癌患者的K-ras基因突变率达51.4%，略高于以往的相关报道[22-23];且左半结肠癌K-ras基因突变率高于右半结肠癌(59.7%对43.1%，P<0.05)。从分子生物学水平看，染色体不稳定性(CIN)是结肠癌发生的重要机制之一。有研究[24]发现左半结肠癌患者的染色体异常率明显高于右半结肠癌；随后，不同研究证实CIN常发生于左半结肠癌[25-26]。CIN可引起癌基因如K-ras突变以及抑癌基因APC、p53失活，从而导致肿瘤的发生。但也有研究[27-28]认为K-ras基因突变好发于近端结肠。目前K-ras基因突变与结肠癌临床病理特征之间的关系仍无明确定论。本研究结果显示，左半结肠癌K-ras基因突变与性别、淋巴结转移、CEA阳性率有关，而与年龄、病理类型、浸润深度、脉管浸润、神经浸润无关。造成这种差异的原因可能与种族、样本量、地域环境因素、检测方法不一致等有关。此外，K-ras突变以点突变为主，其中以12、13密码子突变最为常见[29]。有研究认为K-ras突变与结肠癌患者预后不良有关[30-31]，且12密码子突变患者复发率高于其他位点突变[32]。本研究未能行进一步分析。

本研究MSI的发生率为25.7%，且右半结肠癌的MSI发生率明显高于左半结肠癌(P<0.05)，与以往研究[33-34]结果基本一致。进一步说明左半结肠癌、右半结肠癌发病机制的不同，右半结肠癌可能由MSI触发。目前对MSI与临床病理特征的关系仍无确切定论。本研究发现，右半结肠癌的MSI与性别、年龄、淋巴结转移有关。

综上所述，除临床病理特征方面存在不同外， 左半结肠癌、右半结肠癌的MSI、K-ras基因突变等亦存在差异，进一步阐明左半结肠癌、右半结肠癌为两种不同的疾病，具有不同的生物学行为，为结肠癌的诊断、判断预后和个体化治疗提供了依据。