肠易激综合征患者肠道黏膜菌群和催产素受体表达变化分析*

陈俊杰 杨长青 张晓俊 柯少雄 盛淑婷 魏子白#

长治医学院附属和平医院消化内科1(046000) 长治卫生学校附属医院病理科2

背景：研究表明肠道菌群、催产素受体(OTR)变化在肠易激综合征(IBS)的发病中起有重要作用，但其潜在机制尚未完全阐明。目的：探讨IBS患者肠道黏膜菌群特征和结肠黏膜OTR表达，以及两者之间的相关性。方法：收集2017年7月—2017年12月长治医学院附属和平医院收治的符合罗马Ⅳ标准的IBS-D、IBS-U患者结肠黏膜标本，以13名健康体检者作为对照。利用高通量测序平台对肠道黏膜菌群组成、物种多样性和丰度进行评估。免疫组化法测定结肠黏膜OTR表达。结果：IBS-D组、IBS-U组和对照组肠道黏膜菌群以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为主。三组chao1指数、shannon指数相比差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组相比，IBS组Granulicatella丰度显著减少(H=6.212，P<0.05)，Tissierella丰度显著增加(H=6.688，P<0.05)。IBS-D组Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacteriales、Cardiobacterium、Cardiobacteriaceae丰度均显著高于IBS-U组和对照组(P均<0.05)。IBS-D组、IBS-U组OTR表达均显著高于对照组(P<0.01)。Tissierella丰度与结肠黏膜OTR表达呈正相关(r=0.542，P<0.01)。Tissierella、Granulicatella丰度、结肠黏膜OTR表达与IBS严重程度无明显相关性(P>0.05)。结论：IBS患者肠道黏膜菌群多样性无明显变化，部分菌群丰度发生改变，且不同亚型肠道黏膜菌群丰度变化不同。IBS患者结肠黏膜OTR表达上调，且与Tissierella丰度存在一定相关性。

肠易激综合征(IBS)临床上主要症状为腹痛、腹胀和排便习惯改变，其发病率高，约占总人口的11.2%[1]，严重影响患者的生活质量、社会功能、工作效率，并导致巨大的卫生保健服务成本。目前IBS的发病机制仍不完全清楚，其中肠道菌群紊乱在这一过程中起有重要作用，但尚未对IBS相关肠道菌群的特定组成改变达成共识。有研究[2-3]发现IBS患者肠道催产素受体(oxytocin receptors, OTR)表达上调且可诱导内脏高敏感。故IBS患者肠道菌群紊乱与结肠OTR表达上调可能存在一定联系。本研究通过探讨IBS患者各亚型黏膜相关菌群特征和OTR表达，旨在探讨肠道菌群紊乱与OTR表达之间的相关性。

材料与方法

一、资料来源

选取2017年7月—2017年12月长治医学院附属和平医院收治的IBS患者，诊断符合罗马Ⅳ标准[4]。根据罗马Ⅳ标准将IBS分为四种亚型：①便秘型IBS(IBS-C)：块状或干硬粪便≥25%，糊状或水样粪便<25%；②腹泻型IBS(IBS-D)：糊状或水样粪便≥25%，块状或干硬粪便<25%；③混合型IBS(IBS-M)：块状或干硬粪便、糊状或水样粪便均≥25%；④不定型IBS(IBS-U)：粪便性状不符合上述诊断标准者。硬便或块状便为Bristol分级1～2级，水样便或糊状便为Bristol分级6～7级。纳入标准：①年龄18～60岁；②血尿便常规检查无明显异常；③腹部超声、结肠镜检查无异常。排除标准：①合并其他疾病；②既往有腹部手术史；③近1个月内曾连续使用抗菌药物超过3 d；④近2周内连续服用益生菌、通便药、止泻药、促动力药超过3 d；⑤年龄<18岁或>60岁；⑥处于月经期或哺乳期女性。选取同期健康体检无明显异常者作为对照组。本研究方案通过和平医院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

二、方法

1. 患者病情严重程度评估：由IBS患者根据自身情况填写IBS病情严重程度调查表，并计算评分。

2. 肠黏膜标本收集：入选者禁食，在内镜检查前5 h，将聚乙二醇电解质散(江西恒康药业有限公司)139.12 g溶解于2 L温开水中，每10 min服用250 mL，2 h内服完。从距肛门近端25～35 cm处取黏膜组织2块，分别用于检测肠道黏膜菌群多样性和丰度以及肠道黏膜OTR表达。

3. 肠道黏膜微生物DNA提取和组成评估：利用细菌基因组DNA提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，严格按照说明书提取肠道黏膜菌群DNA，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检。PCR扩增基因组DNA，扩增选择区域为V3～V4区，引物为F341和R806[5]，采用Illumina MiSeq平台进行测序(由上海锐翌生物科技有限公司完成)。

4. 免疫组化法测定结肠黏膜OTR蛋白表达：按照两步法进行免疫组化染色(试剂购自Abcam公司，工作浓度为1∶250)，封片后在显微镜下观察并摄片。结果判定：细胞质中出现棕黄色颗粒沉淀为阳性细胞。每张切片选取视野清晰的5个不重复的高倍视野(×400)，运用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件，计算光密度值并取均值。

三、统计学分析

结 果

一、基本情况

研究期间，共纳入25例IBS患者，其中男11例，女14例，平均年龄为(47.16±11.01)岁；IBS-U患者10例，其中男2例，女8例，平均年龄为(48.40±12.01)岁，严重程度评分为213.33±30.95；IBS-D患者15例，其中男9例，女6例，平均年龄为(46.33±10.64)岁，严重程度评分为210.67±45.27。对照组13名，其中男6名，女7名，平均年龄为(48.62±11.94)岁。IBS组和对照组性别构成比、年龄相比差异均无统计学意义(χ2=0.016，P>0.05；t=0.376，P>0.05)。IBS-D组与IBS-U组性别构成比、年龄、严重程度评分相比差异均无统计学意义(χ2=2.442，P>0.05；t=-4.52，P>0.05；t=-0.175，P>0.05)。

二、肠道菌群组成分析

IBS-D组、IBS-U组和对照组肠道黏膜相关菌群在门水平上以变形菌门(37.8%、43.2%、46.6%)、厚壁菌门(29.5%、26.4%、29.1%)、拟杆菌门为主(25.4%、23.7%、16.7%)(图1)。

三、肠道菌群多样性分析

Alpha多样性分析显示，IBS-D组、IBS-U组和对照组之间chao1指数、shannon指数相比差异无统计学意义(P>0.05)(图2)。

四、肠黏膜菌群丰度差异分析

与对照组相比，IBS组Granulicatella丰度明显减少(H=6.212，P<0.05)；Tissierella丰度明显增加(H=6.688，P<0.05)。IBS-D组Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola、Cardiobacteriales、Cardiobacterium、Cardiobacteriaceae丰度明显高于IBS-U组和对照组(P均<0.05)(图3)。

五、结肠黏膜OTR表达

免疫组化结果显示，对照组、IBS-D组、IBS-U组结肠黏膜OTR表达分别为0.115±0.031、0.162 ±0.039、0.156 ±0.032，三组相比差异有统计学意义(F=7.045，P<0.01)。进一步分析发现，IBS-D组、IBS-U组OTR表达显著高于对照组(P<0.05)，而前两组之间无明显差异(P>0.05)(图4)。

六、OTR表达与Granulicatella、Tissierella之间的相关性

Pearson相关分析发现，结肠黏膜OTR表达与Granulicatella丰度无关(r=0.156，P=0.350)，而与Tissierella丰度呈正相关(r=0.542，P<0.01)。

七、Granulicatella、Tissierella丰度、OTR表达与IBS严重程度评分相关性

Pearson相关分析发现，Granulicatella、Tissierella丰度、OTR表达与IBS严重程度评分均无关(r=-0.187，P=0.372；r=-0.186，P=0.374；r=0.132，P=0.529)。

图1 各组门水平上菌群组成

A：chao1指数；B：shannon指数

*P<0.05

A：对照组；B：IBS-D；C：IBS-U；D：OTR表达(#P<0.01)

讨 论

IBS是临床常见的肠道功能紊乱之一。Rangel等[6]发现IBS患者存在肠道菌群组成的改变。Crouzet等[7]将IBS患者粪便移植至无菌大鼠后，内脏敏感性明显升高。使用抗菌药物、益生菌或益生元可改变IBS患者肠道菌群的组成，从而改善症状[8-9]。由此可见，肠道菌群在IBS中起有重要作用。本研究中，IBS患者肠道黏膜菌群以变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门为主，且菌群多样性与对照组无明显差异。与Tap等[10]的研究结果一致。与对照组相比，IBS组Granulicatella丰度明显减少，Tissierella丰度明显升高；IBS-D组Cardiobacteriales、Cardiobacteriaceae、Cardiobacterium、Syntrophaceae、Porphyromonas、Marmoricola丰度明显高于IBS-U组和对照组。而Liu等[11]发现，与健康对照组相比，IBS患者乳酸杆菌、双歧杆菌和普氏粪肠球菌丰度存在显著差异，尤其是IBS-D患者乳酸杆菌和双歧杆菌丰度明显降低。各研究间结果不一致可能与研究对象的种族、饮食、文化、经济条件和地理位置差异，以及肠道菌群和粪便菌群存在差异等因素相关。

目前对肠道菌群的研究多基于粪便标本，仅少部分数据来自黏膜组织，这可能与粪便标本取样简单、来源丰富且易被研究对象所接受等优势有关。但粪便样品在排便过程中容易受到污染和外部干扰，且有研究发现粪便标本微生态组成随收集时间变化而改变[12]。因此，黏膜标本更能准确反映肠道微生态改变。此外，有研究表明粪便标本的微生态组成与肠道黏膜组织标本存在显著差异[6]，且粪便菌群和黏膜菌群在肠道可能发挥不同作用，粪便菌群主要通过其代谢产物影响肠道功能[13]，黏膜菌群可直接参与宿主免疫系统的相互作用[14]。

本组IBS-D组常见口腔致病菌Porphyromonas、Cardiobacterium丰度明显高于对照组和IBS-U组，提示可能存在与IBS-D相关的口-肠移位途径。IBS-D组Syntrophaceae丰度明显高于对照组和IBS-U组。有研究发现Syntrophaceae可促进甲烷的产生[15]，这可能与IBS-D患者腹胀、腹部不适相关。

OTR属于G蛋白耦联受体家族。Gong等[16]发现大鼠和人肠道黏膜肥大细胞上均有OTR表达，在内脏高敏感中起重要作用。有研究[3]表明OTR拮抗剂阿托西班可促进母婴分离大鼠模型内脏高敏感的恢复，提示OTR可能在内脏高敏感中起有重要作用。本研究发现，与对照组相比，IBS组结肠黏膜OTR表达上调，进一步验证了上述研究结果。

Buffington等[17]的研究发现母体高脂饮食可导致后代肠道微生物组的改变，并诱导行为改变，进一步研究发现母体高脂饮食后代下丘脑中催产素(OT)免疫反应神经元较少，这些改变可通过选择性重新引入共生菌菌株而得以恢复。Sgritta等[18]发现罗伊乳酸杆菌可作用于迷走神经，恢复自闭症小鼠模型中脑腹侧背侧核被盖区内的社交诱导的突触可塑性，从而逆转小鼠社会行为缺陷；但对OTR缺乏的小鼠则无此作用。Varian等[19]发现细菌产物肽类或代谢产物可能调节宿主OT分泌。上述研究表明肠道细菌及其代谢产物可影响宿主OT-OTR通路。本研究中，结肠OTR表达与Tissierella丰度存在明显正相关，与上述研究结果一致。Tissierella主要分解肌酐产生乙酸盐，有研究[20]表明肠道菌群代谢产物短链脂肪酸可导致大麻素受体和阿片受体在肠道表达下降，加重IBS疼痛。推测Tissierella代谢产物可能引起OTR表达上调，从而导致IBS内脏高敏感，但由于研究条件受限，未能进一步验证Tissierella与OTR之间的作用机制。

此外，本研究结果显示结肠黏膜OTR表达、Granulicatella、Tissierella丰度与IBS患者严重程度无关，可能与IBS发病机制复杂相关。

总之，IBS亚型和对照组之间黏膜相关菌群差异可能是由于特定菌群的相对丰度改变造成的，而非整体改变所致。Tissierella丰度与结肠黏膜OTR表达存在一定相关性。这为进一步研究肠道黏膜菌群、OTR在IBS发病中的作用提供了理论基础，但具体机制仍有待进一步研究。