老年比格犬肝脏分子生物学变化及其意义

张晓莉 郑松柏 李小雯

复旦大学附属华东医院消化科(200040)

背景：肝脏储备功能随增龄而逐渐下降，老年人肝组织形态学存在明显退变，肝损伤发生率和死亡率明显高于青年人。目的：探讨老年比格犬肝脏分子生物学变化及其意义。方法：将15只健康比格犬分为中青年组和老年组。采用ELISA法测定肝组织Bcl-2、Bax、TE、GSK-3、caspase-9、HA、LN、PCⅢ、ColⅣ以及CYP1A2含量，生化法测定GSH-Px含量；荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别检测肝组织PDGF-B、TGF-β1、TGF-β3 mRNA表达和蛋白表达。结果：与中青年组比较，老年组肝细胞再生相关分子Bcl-2、Bax、TE、caspase-9含量均显著增加(P<0.05)，GSK-3含量显著降低(P=0.013)；肝氧化应激相关分子GSH-Px活性显著降低(P=0.012)；肝药物代谢酶CYP1A2含量显著降低(P=0.006)；肝纤维化指标LN、PCⅢ含量明显增加(P<0.05)，而两组HA、ColⅣ含量无明显差异。老年组肝纤维化相关分子PDGF-B、TGF-β1 mRNA和蛋白表达显著高于中青年组(P<0.05)；TGF-β3 mRNA表达亦明显增加(P=0.035)，而蛋白表达显著降低(P=0.004)。结论：老年肝组织内发生了一系列分子生物学变化，这些变化是肝组织形态学变化的基础，其潜在的临床价值有待进一步研究和开发。

了解肝脏老化的特点和规律及其机制对深入研究老年人肝脏疾病的发病机制、临床特点并采取有效防治措施具有重要意义。杜杰[1]通过L-[1-13C]-苯丙氨酸呼气试验对老年人肝脏储备功能进行评估发现，70岁后开始出现可观察到的肝脏储备功能衰退。动物实验发现老年肝脏组织学和超微结构存在明显退变[2]。对啮齿类动物肝脏增龄过程中某些生物学变化的分析，可能部分揭示了上述退化的特点，但总体研究仍不多。本研究通过对老年比格犬肝脏分子生物学变化(包括肝细胞再生相关分子、氧化应激相关分子、肝药物代谢酶、肝纤维化指标及其相关因子的变化等)进行分析，旨在为进一步研究肝脏老化的内在机制提供线索。

材料与方法

一、实验动物

15只国际标准实验用健康比格犬，年龄1.5～10.6岁，饲养于中国科学院上海药物研究所。依据http://www.maxiebeagle.com/dogage.htm上对比格犬年龄的研究，将其分为老年组和中青年组，其中老年组7只，平均年龄(8.26±1.52)岁，中青年组8只，平均年龄(2.21±0.94)岁。

二、 方法

1. 组织收集：实验犬禁食、禁饮12 h后麻醉，自腹中线逐层解剖，露出肝脏，观察肝脏外观正常后在肝右叶、距肝边缘3～5 cm处取大小约1 cm×1 cm的组织2块。液氮冰冻，-80 ℃保存备用。

2. ELISA法：采用ELISA测定Bcl-2、Bax、端粒酶(TE)、糖原合成酶激酶-3(GSK-3)、caspase-9、透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、Ⅲ型前胶原蛋白 (PCⅢ)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)、CYP1A2含量，具体步骤参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书操作。

3. 荧光定量PCR法检测血小板衍生生长因子-B(PDGF-B)、转化生长因子β1(TGF-β1)、TGF-β3 mRNA表达：以Trizol(Invitrogen公司)提取肝脏组织总RNA，反转录成cDNA，行荧光定量PCR。扩增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 40 s，共40个循环；结束后即刻进行溶解曲线分析。采用2-ΔΔCt法计算各目的基因mRNA表达。

4. 蛋白质印迹法：参照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书步骤检测肝组织内PDGF-B(兔多克隆抗体，以1∶200的比例稀释)、TGF-β1(山羊多克隆抗体，以1∶200的比例稀释)、TGF-β3(小鼠单克隆抗体，以1∶200的比例稀释)表达。以β-actin(兔单克隆抗体，以1∶1 000的比例稀释)作为内参，蛋白表达量=各处理组蛋白条带的光密度值/内参蛋白条带光密度值。

5. 其他指标：采用生化法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性。

三、统计学分析

表1 PDGF-B、TGF-β1、TGF-β3的PCR引物序列

结 果

一、肝细胞再生相关分子

与中青年组相比，老年组Bcl-2、Bax、TE和caspase-9含量均显著增加(P<0.05)，GSK-3含量显著降低(P<0.05)，而两组Bax/Bcl-2比值无明显差异(表2)。

二、肝氧化应激相关分子

老年组GSH-Px活性显著低于中青年组[(16.92±1.02) U/mg蛋白对(18.73±1.33) U/mg蛋白；t=2.929，P=0.012]。

三、肝药物代谢酶

老年组CYP1A2含量显著低于中青年组[(3.54±0.23) ng/mL对(3.95±0.25) ng/mL；t=3.239，P=0.006]。

四、肝纤维化指标

老年组LN和PCⅢ含量显著高于中青年组(P<0.05)，而两组HA、ColⅣ含量无明显差异(P>0.05)(表3)。

五、肝纤维化相关分子

老年组PDGF-B、TGF-β1 mRNA和蛋白表达明显高于中青年组(P<0.05)；TGF-β3 mRNA表达亦明显增加(P<0.05)，而蛋白表达明显减少(P<0.05)(表4、图1)。

讨 论

肝脏有强大的再生能力[3]，但老年肝细胞的再生能力下降，肝细胞数目减少[4]。Bcl-2和Bax同属一个家族，是细胞凋亡的重要调节分子，Bcl-2可维持线粒体膜的完整性并阻止细胞凋亡，为凋亡抑制基因；Bax的功能则相反，可增加线粒体膜通透性，诱导细胞色素C释放至胞质，促发caspase-9等一系列分子的瀑布式激活，诱导细胞凋亡，为凋亡促进基因[5]。TE是使端粒延伸的反转录DNA合成酶，其活性可反映细胞增殖状态，TE缺失致细胞衰老并驱动肝脂肪变性[6-7]。GSK-3是一种多功能蛋白激酶，通过调节细胞周期蛋白、Nrf-2核内转移等促进细胞增殖分子以及抗氧化酶的表达，可促进细胞增殖并减少细胞应激损伤[8-10]。本研究发现，与中青年组相比，老年比格犬肝组织内Bax、caspase-9含量显著增加，GSK-3显著降低，表明老年肝细胞凋亡增加，而增殖受到抑制；但肝组织内Bcl-2、TE含量增加，表明老年肝细胞凋亡仍受到一定抑制且有一定的增殖能力。因此，老年肝细胞的再生能力下降、肝细胞数目减少可能是老年肝细胞凋亡、增殖及其强弱程度等多方面因素共同作用的结果，有关机制需进一步研究。

1 Da=0.992 1 u

有实验表明，同等外来刺激下，老年大鼠肝细胞损伤较年轻者明显加重[11]。GSH-Px是肝脏重要的过氧化物分解酶，亦是抗氧化应激系统主要成分之一，对肝脏损伤有重要的保护作用[12]。本研究结果显示老年比格犬肝细胞GSH-Px活性较中青年组明显减少, 提示老年肝脏抗氧化应激能力下降。

CYP450主要存在于肝脏，主要作用为催化药物等外源性物质的代谢。有研究报道，诸多CYP亚型含量和活性随增龄而降低，药物转出体减少、代谢率降低[13-14]，引起肝损伤[12]。CYP1A2是肝药物代谢酶的常见亚型，对多种常用药物具有代谢转化作用。本研究发现老年比格犬CYP1A2含量较中青年组明显下降。肝药物代谢酶含量和活性降低是老年人药物性肝损伤高发的重要原因之一[15]。

形态学研究证实，肝细胞外基质(ECM)随着增龄而增加[2]。本研究发现，老年比格犬肝纤维化指标LN、PCⅢ显著高于中青年组，说明老年比格犬ECM沉积增多。ECM主要由活化的肝星状细胞产生和分泌，其最重要的刺激分子为PDGF-B和TGF-β1，而TGF-β3与TGF-β1相互拮抗，可抑制ECM分泌[16]。本研究荧光定量PCR结果显示，老年比格犬肝组织PDGF-B、TGF-β1 mRNA表达较中青年组增加10余倍，同时TGF-β3 mRNA表达亦较中青年组增加10余倍。进一步行蛋白质印迹法发现，老年比格犬肝组织PDGF-B、TGF-β1蛋白表达较中青年组显著增加，而TGF-β3 蛋白表达显著降低，导致老年肝脏ECM增加。TGF-β3 mRNA表达增加，可能是器官老化过程常见的一种“退化-代偿”(degeneration-compensation)现象[17]。

表2 中青年组与老年组肝细胞再生相关分子比较

表4 中青年组与老年组肝纤维化相关因子mRNA和蛋白表达比较

表3 中青年组与老年组肝纤维化指标比较

总之，肝脏储备功能决定了其对各种药物代谢、疾病发生和应激反应的最终临床表现。研究指出，老年人肝脏衰老虽较其他器官相对缓慢，但其储备功能随增龄而下降，尤以高龄老人(>80岁)更为明显[1]。有研究认为，高龄是肝脏术后发生并发症的独立危险因素[18]。老年人肝脏对药物、应激的耐受力较中年人明显下降，药物性肝损、应激后暴发性肝衰竭的发生率、死亡率明显升高，对老年人生活质量、医疗资源均造成了极大负担，故急需寻找老年人肝脏老化的特点以及干预靶点，以降低各种原因所致肝衰竭的发生率和死亡率。本研究通过对老年比格犬肝组织内多种生物活性因子变化的观察，为肝脏老化的某些形态学变化和临床现象找到了分子生物学依据，但本研究还得出了一些看似矛盾的结果；深入研究这些变化的内在机制，尤其是其上游通路和关键靶点，并进行干预，将对延缓肝脏衰老、提高老年人肝病防治水平具有重要意义。