ICOS在结直肠癌组织中的表达及其临床意义*

吕 强 李 靖 钟 鸣 骆 洋 蔡晓燕&

上海市浦东新区公利医院普外科1(200135) 上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科2

背景：可诱导T细胞共刺激分子(ICOS)属于B7-CD28免疫球蛋白家族，参与细胞增殖、分化以及免疫应答等多种生物学过程，其表达异常与肿瘤免疫逃逸密切相关。目的：探讨ICOS在结直肠癌中的表达及其临床意义。方法：收集32对新鲜结直肠癌组织和相应癌旁非癌组织，以及211例石蜡包埋结直肠癌组织，分别采用real-time PCR和免疫组化法检测ICOS mRNA和蛋白表达，分析其表达与患者临床病理特征和预后的相关性。结果：与非癌组织相比，ICOS在结直肠癌组织中呈低表达(P<0.05)，其表达与肿瘤大小、血清CEA水平、淋巴结转移、远处转移和TNM分期呈显著负相关(P均<0.05)，与肿瘤发生部位无明显相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存曲线分析显示，结直肠癌患者ICOS表达水平越低，预后越差(P<0.05)。多因素Cox回归分析显示，ICOS表达水平是结直肠癌患者的临床预后指标之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912, P=0.034)。结论：ICOS低表达可能在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用，并与预后不良相关。ICOS有望成为结直肠癌预后的分子标志物。

结直肠癌(colorectal cancer)是我国最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率呈逐年上升趋势，均位居所有恶性肿瘤的第五位[1]。近年来，尽管手术联合放化疗等综合治疗手段的广泛应用提高了结直肠癌患者的生存率，但目前其总体生存率仍较低，多数患者确诊时已是中晚期。因此，寻找结直肠癌发生、发展中的关键分子靶点并对之进行有效调控以改善患者预后成为当前研究热点。

B7-CD28免疫球蛋白家族是最广泛的T细胞共刺激分子，其中的抑制性分子程序性死亡分子-1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4(CTLA-4)是目前肿瘤研究中的亮点，针对这两个靶分子的单克隆抗体药物nivolumab和ipilimumab已在多种恶性肿瘤中显示出良好的疗效[2-3]。与此同时，B7-CD28家族中的激活性分子也日益受到重视。可诱导T细胞共刺激分子(inducible T-cell co-stimulator, ICOS)是B7-CD28家族成员之一，与经典分子CD28同属于激活性分子，可刺激抗原特异性T细胞反应，参与细胞增殖、分化以及免疫应答等多种生物学过程，其表达异常与肿瘤免疫逃逸密切相关[4-5]。本研究旨在探讨ICOS在结直肠癌中的表达及其与肿瘤临床病理特征和患者预后的相关性。

材料与方法

一、标本来源

用于real-time PCR的32对新鲜结直肠癌组织和相应癌旁非癌组织(距肿瘤边缘>5 cm)来源于2018年1月—2018年12月浦东新区公利医院普外科手术标本；用于免疫组化检测的211例石蜡包埋结直肠癌组织来源于2005年1月—2015年12月浦东新区公利医院普外科和上海交通大学医学院附属仁济医院胃肠外科手术标本。上述患者术前均未接受新辅助化疗或其他针对肿瘤的治疗，所有标本均经组织病理学检查确诊。通过门诊或电话随访获取患者预后信息。

二、主要试剂

TRIzolTM试剂(InvitrogenTM, Thermo Fisher Sci-entific)；反转录试剂盒、real-time PCR试剂盒[宝生物工程(大连)有限公司]；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]；ICOS兔单克隆抗体(Abcam plc.)；GAPDH抗体、HRP标记山羊抗兔IgG(Pro-teintech Group)。

三、方法

1. Real-time PCR：使用TRIzol试剂抽提组织总RNA，反转录合成cDNA，反转录条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s。ICOS引物：F 5’-TGT CAG GGC ACA ATT CCC TC-3’, R 5’-ACC CCA CAC ACA GAA ACC TG-3’；内参GAPDH引物：F 5’-ACT CGT CAT ACT CCT GCT-3’, R 5’-GAA ACT ACC TTC AAC TCC-3’。PCR条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。2-ΔΔCT法计算mRNA相对表达量。实验重复3次。

2. 免疫组化染色：组织石蜡切片二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化，0.3% H2O2孵育15 min，微波修复15 min，自然冷却后10%牛血清白蛋白封闭30 min，滴加经PBS稀释的ICOS抗体(1∶300)，4 ℃过夜，HRP标记二抗孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片，光学显微镜下观察。

ICOS阳性染色主要定位于肿瘤细胞和肿瘤间质细胞。光学显微镜下随机观察10个高倍视野，记录1 000个肿瘤细胞的ICOS阳性细胞百分比，结合染色强度进行半定量评分[6]。阳性细胞百分比评分：1%～25%，1分；25%～50%，2分；>50%，3分。染色强度评分：弱(淡黄色)，1分；中(棕黄色)，2分；强(棕褐色)，3分。总分为两项评分之积：1～3分为低表达，≥4分为高表达。

四、统计学分析

结 果

一、ICOS mRNA表达

以real-time PCR检测32对结直肠癌组织和相应癌旁组织中的ICOS mRNA表达，结果显示癌组织ICOS mRNA表达水平明显低于相应癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.05)(图1A)。按肿瘤大小以及有无淋巴结转移和远处转移进行分层分析，肿瘤>5 cm(图1B)、有淋巴结转移(图1C)和有远处转移(图1D)的结直肠癌患者癌组织中ICOS mRNA表达水平相对较低，差异均有统计学意义(P<0.05)。上述结果表明，ICOS mRNA在结直肠癌组织中呈低表达，并可能影响肿瘤发生、发展。

二、ICOS蛋白表达

为明确ICOS在结直肠癌组织中的表达和定位，进一步对211例结直肠癌组织进行ICOS免疫组化染色，结果显示癌组织ICOS蛋白高表达率为52.1%(110/211)，光学显微镜下可见肿瘤细胞、肿瘤间质细胞的细胞膜和(或)细胞质出现淡黄色至棕褐色颗粒；值得注意的是，TNM Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ICOS蛋白几乎不表达或为低表达(图2)。上述结果表明，ICOS蛋白在结直肠癌组织中呈低表达，TNM分期越晚，其表达越低。

三、ICOS表达与结直肠癌临床病理特征的相关性

根据免疫组化评分结果将211例结直肠癌组织分为ICOS 低表达组(n=101)和ICOS高表达组(n=110)，χ2检验显示ICOS蛋白表达与肿瘤大小、血清CEA水平和TNM分期显著相关(P<0.05)，与患者性别、年龄和肿瘤部位无明显相关性(P>0.05)(表1)。

四、ICOS表达与结直肠癌预后的关系

为验证ICOS表达对结直肠癌预后的影响，采用Kaplan-Meier生存曲线和log-rank检验对ICOS低表达与高表达结直肠癌患者进行生存分析，结果表明ICOS表达水平与患者预后呈显著正相关，表达水平越低，预后越差(P<0.05)(图3)。

单因素Cox比例风险模型分析显示，肿瘤组织ICOS表达水平、肿瘤大小、TNM分期为结直肠癌预后的预测指标(P<0.05)；将单因素分析中有统计学意义的变量进一步纳入多因素分析，结果显示肿瘤组织ICOS表达水平是影响结直肠癌患者临床预后的指标之一(HR=0.821, 95% CI: 0.588～0.912,P=0.034)(表2)。

讨 论

尽管ICOS与经典分子CD28同属于激活性T细胞共刺激分子，但两者存在很大差异。CD28常规表达于T细胞表面，主要为T细胞激活提供必需的共刺激活化信号；而ICOS则只表达于活化T细胞或肿瘤细胞表面，其信号通路可促进不同类型的T细胞分泌白细胞介素-10(IL-10)、IL-4、IL-5、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-17等细胞因子[4，6-7]。研究显示ICOS在肿瘤发生、发展中具有双重作用，其既可参与抗肿瘤T细胞免疫应答，又可通过调节性T细胞的免疫抑制活性发挥促肿瘤效应[8]。因此，ICOS被视为抗肿瘤治疗的潜在靶点。既往研究发现ICOS在胃癌、乳腺癌、肾细胞癌、肝细胞癌等多种恶性肿瘤组织中表达异常，且其表达水平与患者预后有关[9-13]。

A：结直肠癌组织与相应癌旁组织ICOS mRNA表达比较；B、C、D、肿瘤>5 cm、有淋巴结转移和远处转移结直肠癌患者癌组织中ICOS mRNA表达水平相对较低

图1ICOS mRNA在32对结直肠癌组织和相应癌旁组织中的表达情况

图2 结直肠癌组织ICOS蛋白表达情况(免疫组化染色，×20)

表1 ICOS表达与结直肠癌临床病理特征的相关性n(%)

图3 ICOS低表达与高表达结直肠癌患者生存分析

本研究采用real-time PCR和免疫组化染色检测ICOS在结直肠癌组织及其相应癌旁组织中的表达，以探讨ICOS在结直肠癌发生、发展中的作用及其与患者预后的关系。结果显示ICOS mRNA和蛋白在结直肠癌组织中均呈低表达，其表达水平与肿瘤大小、血清CEA水平、淋巴结转移和远处转移以及TNM分期呈显著负相关，与患者预后呈显著正相关。Cox比例风险模型分析证实ICOS表达水平是影响结直肠癌患者临床预后的因素之一。推测在结直肠癌中，ICOS低表达可能参与了肿瘤细胞的免疫逃逸，从而促进肿瘤细胞迁移和侵袭。肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力与肿瘤复发和转移密切相关，进而影响患者预后。

近年来越来越多的研究表明左半结肠癌与右半结肠癌在分子特征、癌变途径等方面存在明显差异，如正常右半结肠上皮细胞的人类错配修复基因(hMLH1)启动子甲基化水平和O-6-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)表达明显高于左半结肠；右半结肠癌与BRAF基因突变显著相关，其发生更多经由锯齿状腺瘤-癌途径，而左半结肠癌的发生常为传统腺瘤-癌途径[14-17]。本研究中ICOS在左半结肠癌与右半结肠癌组织中的表达并无明显差异，表明其低表达在结直肠癌中的作用无位置特异性。原发部位不同的结直肠癌，预后也有较大差异。对于中晚期患者，左半结肠癌的复发后存活率明显优于右半结肠癌[15]，但本研究预后因素分析显示肿瘤部位并非结直肠癌的预后影响因素，可能与本研究入组患者例数较少有关，有待后续收集更多结直肠癌组织样本做进一步分析。

表2 结直肠癌预后相关因素分析(Cox比例风险模型)

综上所述，ICOS低表达可能在结直肠癌的发生、发展中发挥重要作用，其表达水平与结直肠癌临床分期和患者预后密切相关，但与肿瘤原发部位无关。ICOS有望成为结直肠癌预后的分子标志物，相关信号通路在结直肠癌中的确切作用有待进一步研究。

(2018-09-29收稿；2019-01-01修回)