SPINK1基因多态性对乌司他丁治疗急性胰腺炎疗效的影响

李 红 胡志军

陕西省宝鸡市中医医院脾胃肝病二科(721000)

背景：乌司他丁是急性胰腺炎(AP)的重要治疗药物，然而不同患者的疗效具有一定差异。目的：探讨SPINK1基因多态性对乌司他丁治疗AP疗效的影响。方法：纳入2005年1月—2015年12月宝鸡市中医医院收治的AP患者572例，静脉滴注乌司他丁100 000 U治疗。采用PCR法检测SPINK1基因多态性，ELISA法检测血清TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10以及血尿淀粉酶水平，并评估乌司他丁的疗效。结果：AP患者c.101A>G位点突变率明显高于对照组(P<0.05)。c.200G>A位点突变的SPINK1 mRNA表达显著降低(P<0.05)。c.36G>C、c.200G>A位点突变的黄疸缓解率均显著低于野生型(P<0.05)。c.200G>A位点突变的TNF-α、IL-8水平显著低于野生型(P<0.05)。c.200G>A组患者血尿淀粉酶阳性数减少的趋势较平缓。c.36G>C、c.200G>A位点突变的治疗有效率显著低于野生型(P<0.05)。结论：AP患者c.101A>G突变率高于普通人群，c.36G>C、c.200G>A位点突变能影响乌司他丁对AP患者的疗效。

急性胰腺炎(acute pancreatitis, AP)是普外科常见的危急重症，主要症状为饱餐或饮酒后突发的上腹部或左上腹部持续性剧痛，伴恶心、呕吐、发热以及血淀粉酶增高。AP病情凶险，进展迅速，若未得到及时有效的治疗，预后较差。随着人民生活水平的提高和饮食习惯的改变，AP的发病率逐渐呈上升趋势[1]。因此探讨AP的治疗方法具有重要意义。乌司他丁是目前公认安全价廉的胰蛋白酶抑制剂[2-3]，可用于治疗AP。乌司他丁能有效降低AP患者血清CRP、IL-6、TNF-α表达水平，具有潜在的抗感染作用[2]。然而,不同AP患者对乌司他丁的疗效仍具有一定差异，患者个体基因多态性可能是重要的影响因素之一[4]。

丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal 1型(serine protease inhibitor Kazal type 1, SPINK1)是近年发现的与慢性胰腺炎和胰腺癌相关的一种酶抑制剂，其丢失与慢性胰腺炎和胰腺癌的发生、发展有关[5-6]。然而，目前关于SPINK1对乌司他丁疗效影响的研究较为少见。本研究通过检测AP患者SPINK1基因多态性，旨在探讨不同SPINK1突变位点对乌司他丁治疗效果的影响，从而为实现个体化用药提供一定的理论依据。

对象与方法

一、研究对象

纳入2005年1月—2015年12月宝鸡市中医医院就诊的AP患者572例。所有患者均符合中华医学会消化病学分会胰腺疾病学组制定的《中国急性胰腺炎诊治指南(2013年,上海)》诊断标准[7]：有急性、持续性腹痛等临床表现；血、尿淀粉酶显著升高以及影像学检查(超声或CT)显示胰腺形态学发生改变；病程小于1周。同时排除慢性胰腺炎急性加重者。572例AP患者中，男性432例，女性140例；平均年龄(40.2±6.7)岁；平均病程(1.6±0.2) d；APACHEⅡ评分(6.2±1.5)分；发病原因为胆囊性疾病205例，酒精性疾病238例，不明原因129例；轻度399例，重度173例。另取同期行健康体检者549名作为对照组，其中男性427名，女性122名，平均年龄(41.0±8.6)岁。两组性别、年龄相比无明显差异(P>0.05)，具有可比性。本研究方案经宝鸡市中医医院医学伦理委员会审批通过，入选者均取得知情同意。

二、方法

1. 治疗方案：持续监测AP患者生命体征，常规给予禁食、吸氧、镇静、补液、营养支持，必要时给予胃肠减压、抗感染治疗。在此基础上接受注射用乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司，国药准字H19990133)治疗。将乌司他丁100 000 U溶于5%葡萄糖注射液250 mL中，静脉滴注2 h，2次/d，3 d后改为1次/d，疗程共5～10 d。

2. 基因突变的检测：患者入院后抽取静脉血 5 mL置于抗凝管中，10 000 r/min离心3 min，弃上清；双蒸水200 μL重悬，样品中加入150 μL NaCl，室温8 000 r/min离心20 min，去沉淀，然后在上清液中加入等体积预冷异丙醇，混匀，20 ℃处理30 min，14 000 r/min离心10 min，去上清液，加70%乙醇500 μL，13 000 r/min离心12 min；弃乙醇，沉淀干燥后，加TE缓冲液30 μL溶解DNA。应用Primer Express软件设计突变引物序列(表1)。PCR反应体系：模板DNA 50 ng，15 μmol/L上、下游引物1 μL，0.2 mmol/L dNTP 5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，1 U Taq酶1 μL (Promega公司)，补充ddH2O至体积为50 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 7 min。上美国ABI公司9700型 PCR仪。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，切下DNA条带，使用胶回收试剂盒(Qiagen公司)进行溶胶、过柱、洗涤、洗脱，交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行基因测序。

3. mRNA表达的检测：TRIzol法提取血液RNA，采用RT-qPCR法检测SPINK1 mRNA表达[8]，具体步骤按试剂盒说明书操作。

表1 突变引物序列

4. ELISA法：分别于入院后第0、5、7、10天抽取患者抗凝血5 mL，10 000 r/min离心3 min，取上清，采用ELISA法(试剂盒购自晶美生物工程有限公司)检测血清TNF-α、IL-2、IL-8、IL-10以及血淀粉酶水平，留取尿液检测尿淀粉酶水平。血淀粉酶>300 U/L定义为阳性，尿淀粉酶>1 000 U/L定义为阳性。

5. 疗效评价：按显效、有效和无效来进行疗效评定。显效：1周内发热、腹痛、呕吐、恶心、黄疸等症状和体征消失，3/4以上的指标降至正常范围；有效：1周内发热、腹痛、呕吐、恶心、黄疸等症状和体征有所好转，1/2以上的指标降至正常范围；无效：1周内发热、腹痛、呕吐、恶心、黄疸等症状和体征无明显缓解或加重，血尿淀粉酶无下降或出现并发症。总有效率(%)=(显效例数+有效例数)/总例数×100%。

三、统计学分析

结 果

一、SPINK1基因突变情况

AP组、对照组均可见SPINK1基因c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C与c.200G>A位点突变，其中AP患者c.101A>G位点的突变率明显高于对照组(3.1%对1.1%)，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 两组患者SPINK1基因多态性 (n)

*与对照组比较，P<0.05

二、不同突变对mRNA表达的影响

PCR结果显示,具有SPINK1基因c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C和c.200G>A突变位点的患者SPINK1 mRNA表达呈下降趋势，其中c.200G>A突变患者SPINK1 mRNA表达显著低于c.101A>G突变患者(0.84±0.09对1.03±0.06，P<0.05)(图1)。

三、疗效评估

1. 临床症状：SPINK1基因发生c.36G>C、c.200G>A位点突变时，AP患者黄疸缓解率均显著低于野生型(83.3%、75.0%对98.3%，P<0.05)，而其余突变位点的腹痛、呕吐、黄疸缓解情况与野生型无明显差异(图2)。

2. 炎症因子：与野生型相比，c.200G>A位点突变者的TNF-α、IL-8水平显著降低(P<0.05)，而其余突变位点的炎症因子水平无明显差异(图3)。

*与c.101A>G突变患者比较，P<0.05

*与野生型比较，P<0.05

*与野生型比较，P<0.05

3. 胰淀粉酶：突变型、野生型患者的血淀粉酶、尿淀粉酶阳性率相比无明显差异(P>0.05)(图4)。对突变型行亚组分析发现，c.200G>A位点突变患者血尿淀粉酶阳性例数减少的趋势较为平缓(图5)。

4. 疗效观察：与野生型相比，c.36G>C、c.200G>A位点突变的AP患者的治疗有效率明显降低(P<0.05)，其余两个突变位点无明显差异(P>0.05)(表3)。

讨 论

AP是由于胰腺外分泌突然增加，胰管内压力增高，胰泡破裂，致使含有大量胰酶的胰液外渗引起的急性自身消化性炎症。SPINK1是一种酶抑制剂，在慢性胰腺炎和胰腺癌中的表达显著低于正常对照组[5]。有研究指出，SPINK1基因突变与无胰腺炎家族史的慢性胰腺炎相关[6]。SPINK1基因N34S突变在特发性慢性胰腺炎中的发生率较高，提示该基因突变可能是特发性慢性胰腺炎发病的危险因素之一[9-10]。本研究结果显示，AP患者和对照组的SPINK1基因均可见c.101A>G、c.163C>T、c.36G>C、c.200G>A位点突变，其中AP患者c.101A>G位点突变率明显高于对照组。

A：血淀粉酶；B：尿淀粉酶

A：血淀粉酶；B：尿淀粉酶

组别例数显效有效无效突变型3615174 c.101A>G18891 c.163C>T8440 c .36G>C6222∗ c. 200G>A4121∗野生型53624127718

*与野生型相比，P<0.05

乌司他丁是一种由143个氨基酸组成、相对分子质量为67 kDa(1 Da=0.992 1 u)的酸性糖蛋白，其价格低廉，症状缓解快，不良反应小，目前广泛用于AP的治疗。多中心随机对照试验显示乌司他丁用于治疗急性水肿型胰腺炎和出血坏死型胰腺炎均有较好的疗效，不良反应较少[11]。王珊等[12]在常规治疗的基础上给予重度AP患者乌司他丁每天3次静脉滴注，可改善患者炎症反应，提高临床疗效。本研究结果显示，AP患者SPINK1基因发生c.36G>C、c.200G>A位点突变时，黄疸缓解率均明显低于野生型；c.200G>A位点突变的TNF-α、IL-8水平明显低于野生型；c.200G>A突变位点的血尿淀粉酶阳性例数减少的趋势最为平缓；c.36G>C、c.200G>A突变位点的总有效率显著低于野生型。说明c.36G>C、c.200G>A位点突变会降低乌司他丁对AP的疗效。c.36G>C突变区域为外显子1，而c.200G>A突变区域位于外显子4，两者均能影响氨基酸的改变，且c.200G>A突变已被证实为致病基因。本研究结果还显示发生c.200G>A突变时，SPINK1 mRNA表达水平下降，可能为其影响乌司他丁对AP患者疗效的机制[13-16]。

综上所述，本研究发现AP患者SPINK1基因c.101A>G位点突变情况高于普通人群，c.36G>C、c.200G>A位点突变能影响乌司他丁对AP患者的疗效，对于后续判断患者的预后具有一定的临床借鉴意义。但研究结论尚需行多中心、大规模前瞻性临床试验进一步证实。