XPO1抑制剂KPT-330对人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2增殖和凋亡的影响*

李苑华 庄燕妍 黄娴娴 陈文颖 黄凤婷 张世能

中山大学孙逸仙纪念医院消化内科(510120)

背景：XPO1(exportin 1)是核质转运的重要介质之一，在多种人类恶性肿瘤中表达增高，参与肿瘤发生、发展进程，是恶性肿瘤的潜在治疗靶点。目的：探讨XPO1在人胰腺癌细胞中的表达、定位以及XPO1抑制剂KPT-330对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响。方法：以蛋白质印迹法检测6株人胰腺癌细胞株和2株人永生化正常胰腺导管上皮细胞株中的XPO1表达，选择XPO1表达量最高的人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2进行后续实验。予MIA PaCa-2细胞不同浓度KPT-330(0.03、0.3、3 μmol/L)或DMSO处理，免疫荧光实验检测XPO1在细胞中的分布，CCK-8实验和克隆形成实验检测细胞增殖，流式细胞分析检测细胞周期和细胞凋亡，蛋白质印迹法检测XPO1和凋亡相关蛋白caspase-3、PARP表达变化。结果：XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2细胞的核膜，经KPT-330处理后，XPO1的核膜高聚现象消失。与DMSO组相比，KPT-330可抑制MIA PaCa-2细胞的XPO1表达，并能抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，作用呈浓度依赖性。机制研究显示KPT-330可诱导MIA PaCa-2细胞发生细胞周期S期阻滞，上调cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达。结论：XPO1抑制剂KPT-330可能通过调节细胞周期分布、诱导细胞凋亡而抑制人胰腺癌细胞增殖。

胰腺癌是恶性程度最高的肿瘤之一，5年生存率约为6%，中位生存期仅约6个月。根据美国癌症协会最新发布的数据，2018年美国胰腺癌新发病例数将达到55 440例，死亡病例数约44 330例，死亡率占年发病率的80%[1]。我国流行病学资料显示中国胰腺癌发病率呈上升趋势[2]。胰腺癌早期诊断困难，大多数患者确诊时已出现转移性病变，根治性手术率低，迄今吉西他滨仍为一线化疗药物，然而因耐药性和毒性反应致临床疗效有限[3]。探索新的治疗靶点和治疗策略将有助于改善胰腺癌患者的预后。

mRNA和特定蛋白质的核质转运是细胞内信号转导的关键步骤，参与细胞增殖、凋亡等生命活动[4]。XPO1(exportin 1)是核质转运的重要介质之一，主要参与介导细胞内物质如相对分子质量大于40 kDa(1 Da=0.992 1 u)的蛋白质分子和部分mRNA、rRNA、U-snRNA等的出核[5-7]。研究发现XPO1在卵巢癌、神经胶质瘤、骨肉瘤、胰腺癌、宫颈癌等多种人类恶性肿瘤中表达增高，可通过多种机制介导肿瘤细胞增殖，因此靶向XPO1的核运输机制成为一些恶性肿瘤的潜在治疗靶点[7]。KPT-330(又称selinexor)是一种人工合成的新型小分子高效口服XPO1抑制剂，目前已在血液系统肿瘤和实体瘤中进行Ⅰ/Ⅱ期临床试验[7-8]。既往文献报道高表达XPO1的胰腺癌患者预后较差[9]。本文旨在探讨XPO1在人胰腺癌细胞中的表达、定位以及KPT-330对人胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响，为临床应用XPO1抑制剂治疗胰腺癌奠定实验基础。

材料与方法

一、细胞株和主要试剂

人永生化正常胰腺导管上皮细胞株hTERT-HPNE和6株人胰腺癌细胞株(PANC-1、SW1990、MIA PaCa-2、BxPC-3、HPAF-Ⅱ、Capan-2)购自中科院上海细胞库，人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6C7由加拿大安大略癌症研究所Ming-Sound Tsao教授惠赠，体外培养传代。DMEM培养基、胎牛血清(FBS)、RIPA裂解液、PVDF膜、牛血清白蛋白(BSA)、EMD MilliporeTMImmobilonTMWestern Chemiluminescent HRP Substrate(ECL超敏发光液)(Thermo Fisher Scientific Inc.)；KPT-330(Selleck.cn)；DMSO(MP Biomedicals,LLC.)；小鼠XPO1单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)；山羊抗小鼠IgG、DAPI染液(北京中杉金桥生物技术有限公司)；Caspase-3、cleaved-caspase-3、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶(PARP)、cleaved-PARP、β-tubulin抗体和相应二抗(Cell Signaling Technology,Inc.)；CCK-8细胞增殖、细胞毒性检测试剂盒(同仁化学研究所)；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(Bender Inc.)；细胞周期检测试剂盒(碧云天生物技术)；细胞培养耗材(Corning Incorporated)。

二、方法

1.细胞培养：MIA PaCa-2细胞使用DMEM培养基(含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养，每2～3 d换液或传代1次，0.02% EDTA与0.25%胰蛋白酶1∶1混合消化，完全培养基中和。

2.实验分组和药物处理：5 mg KPT-330以1.128 4 mL DMSO稀释为10 mmol/L的储存液，使用时以培养基稀释至相应浓度。实验设置4个组别：DMSO组、KPT-330 0.03 μmol/L组、KPT-330 0.3 μmol/L 组和KPT-330 3 μmol/L组。MIA PaCa-2细胞常规培养，待融合至80%～90%时传代，以2×105/孔接种于6孔板，待融合至60%～70%时，将培养基分别更换为含DMSO和含0.03、0.3、3 μmol/L KPT-330的培养基，继续培养所需时长。

3.蛋白质印迹法：各株细胞株培养48 h，各组MIA PaCa-2细胞以含DMSO或相应浓度KPT-330的培养基培养48 h，RIPA裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取总蛋白30 μg上样，恒压浓缩胶60 V、分离胶100 V电泳约90 min，4 ℃ 200 mA转膜 120 min，室温漂洗转印后的PVDF膜3次×10 min，5% BSA室温封闭1.5 h，加入一抗4 ℃孵育过夜，1×TBST洗膜3次×10 min，加入二抗室温孵育 2 h，1×TBST洗膜3次×10 min，ECL超敏发光液显色，ImageJ软件分析、计算目的蛋白相对表达量。实验独立重复3次。

4.免疫荧光实验：各组MIA PaCa-2细胞以4×103/孔接种于已放置10 mm细胞爬片的24孔板，24 h 后分别加入含DMSO或相应浓度KPT-330的培养基，48 h后于培养板中以PBS洗玻片3次，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗3次，0.5% Triton X-100(PBS配制)室温通透 20 min，PBS洗3次，正常山羊血清室温封闭 30 min，加入一抗4 ℃ 孵育过夜，PBST洗3次，加入荧光二抗20～37 ℃孵育1 h，PBST洗3次，加入DAPI避光孵育 5 min，抗荧光淬灭封片液封片，共聚焦显微镜观察、拍照。

5.CCK-8实验：各组MIA PaCa-2细胞以4×103/孔(100 μL)接种于96孔板，培养24 h后分别加入含DMSO或相应浓度KPT-330的培养基，分别培养24 h、48 h和72 h后弃培养基，加入含10% CCK-8的培养基，3 h后于酶联免疫检测仪450 nm波长处测定吸光度(A)值，以未接种细胞、仅加入培养基和CCK-8的空白孔调零。实验独立重复3次，每组设5个复孔。

6.平板克隆形成实验：各组MIA PaCa-2细胞以4×103/孔接种于6孔板，常规培养9 d后，分别以含DMSO或相应浓度KPT-330的培养基培养5 d，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定15 min，0.1%结晶紫染色20 min。以PBS洗去残余染料，自然干燥后拍照，ImageJ软件分析、计算相对克隆数。实验独立重复3次。

7.流式细胞分析：各组MIA PaCa-2细胞以含DMSO或相应浓度KPT-330的培养基培养48 h，以PBS重悬为(1～5)×106/L的细胞悬液，取0.5 mL立即用于细胞凋亡检测，0.5 mL用于细胞周期检测，操作严格按试剂盒说明书进行。实验独立重复3次。

三、统计学分析

结 果

一、XPO1在人胰腺癌细胞中的表达

蛋白质印迹法检测显示，与人永生化正常胰腺导管上皮细胞株H6C7、hTERT-HPNE相比，人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中的XPO1表达明显升高，以MIA PaCa-2细胞升高最为显著(图1)，故选择该细胞株作为研究对象进行后续实验。

二、XPO1在MIA PaCa-2细胞中的分布

免疫荧光实验观察到，XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2细胞的核膜，经KPT-330处理48 h，XPO1的核膜高聚现象消失(图2)。

图1 XPO1在人胰腺癌细胞中的表达

图2 XPO1在MIA PaCa-2细胞中的分布

三、KPT-330对MIA PaCa-2细胞增殖和凋亡的影响

CCK-8实验显示，培养24 h、48 h和72 h后，经KPT-330处理的MIA PaCa-2细胞A值均较同时间点DMSO组降低，KPT-330浓度越高，A值降低越为明显(图3A)。平板克隆形成实验亦显示，与DMSO组相比，随着KPT-330浓度的增高，形成的细胞克隆数逐渐减少(图3B)。

流式细胞分析显示，与DMSO组相比，经KPT-330处理的MIA PaCa-2细胞出现凋亡峰，随着KPT-330浓度的增高，细胞凋亡率逐渐升高(图3C)。蛋白质印迹法检测进一步证实，与 DMSO组相比，随着KPT-330浓度的增高，XPO1表达呈下降趋势，凋亡相关蛋白 cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达逐渐升高(图3D)。

上述结果提示，KPT-330可抑制MIA PaCa-2细胞增殖，诱导细胞凋亡，作用呈浓度依赖性。

图3 KPT-330对MIA PaCa-2细胞增殖和凋亡的影响

四、KPT-330对MIA PaCa-2细胞细胞周期的影响

流式细胞分析显示，与DMSO组相比，随着KPT-330浓度的增高，MIA PaCa-2细胞G1期细胞比例逐渐降低，G2期细胞比例无明显变化，S期细胞比例逐渐升高，结合CCK-8实验结果，提示KPT-330可诱导MIA PaCa-2细胞发生细胞周期S期阻滞(图4)。

讨 论

在多种人类恶性肿瘤中，XPO1异常表达可致多个肿瘤抑制蛋白如Rb、APC、p53、BRAC1、FOXO以及分子伴侣蛋白Hsp90等在细胞内分布异常，从而影响细胞分化、增殖、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为，参与肿瘤发生、发展进程[10]。XPO1介导的出核运动具有特异性，其主要转运含有核输出信号(nuclear export signal,NES)的蛋白出核。NES是一段富含亮氨酸的序列，其所含的疏水残基能与XPO1结合，而XPO1抑制剂则能与含NES的蛋白竞争结合XPO1的疏水性凹槽结构(疏水活性口袋)中的活性Cys528位点，从而抑制出核运动[11-13]。

莱普霉素B(leptomycin B)是第一个被发现的天然XPO1特异性抑制剂[14]，随后研究者相继发现了大量XPO1天然抑制剂，如ratjadone类似物、anguinomycin类似物等[15-16]。然而，天然抑制剂对XPO1的抑制效果不一且不良反应较大，临床应用受到限制。KPT-185和KPT-276是人工合成的XPO1不可逆性抑制剂，具有良好的抗血液系统肿瘤效应[17]。在实体瘤中，人工合成XPO1抑制剂同样显示出明显的抗肿瘤效应。在K-ras基因突变非小细胞肺癌中，XPO1抑制剂能显著抑制肿瘤细胞增殖，促进细胞凋亡[18]；在前列腺癌细胞中，XPO1抑制剂可抑制肿瘤细胞生长、迁移、侵袭，显著延长荷瘤动物模型的生存期[19]。在胰腺癌中，XPO1抑制剂亦有明显的抑癌作用。胰腺癌组织中XPO1表达显著增高，并与血清肿瘤标记物CEA、CA19-9水平、淋巴结转移和肝转移以及患者预后不良显著相关[9]。在胰腺癌细胞以及裸鼠皮下和原位移植瘤模型中，XPO1抑制剂可显著抑制肿瘤细胞增殖和肿瘤生长，诱导肿瘤细胞凋亡[20]，其机制可能与促进具有促凋亡作用的肿瘤抑制蛋白PAR-4表达并在核内聚集有关[20-21]。近年研究[22]发现新一代XPO1抑制剂KPT-330能增强胰腺癌对吉西他滨的化疗敏感性。因此，进一步探索XPO1在胰腺癌中的表达以及KPT-330对胰腺癌细胞生物学行为的影响具有重要意义。

本研究首先采用蛋白质印迹法检测XPO1在人永生化正常胰腺导管上皮细胞株hTERT-HPNE、H6C7和6株人胰腺癌细胞株中的表达，结果显示与hTERT-HPNE、H6C7细胞相比，XPO1在人胰腺癌细胞株MIA PaCa-2、Capan-2、PANC-1、SW1990中呈高表达，提示XPO1异常高表达或与胰腺癌的发生、发展存在密切联系。其次，通过免疫荧光实验可观察到XPO1主要聚集分布于MIA PaCa-2细胞的核膜，而XPO1抑制剂KPT-330处理可使XPO1核膜高聚现象消失。体外功能实验显示，与DMSO组相比，随着KPT-330浓度的增高，MIA PaCa-2细胞XPO1表达呈下降趋势，发生细胞周期S期阻滞，细胞增殖明显受抑并出现凋亡峰，凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3、cleaved-PARP表达升高，提示KPT-330可下调人胰腺癌细胞XPO1表达，抑制人胰腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡，作用随药物浓度的增高而增强，这一效应可能与其诱导肿瘤细胞细胞周期阻滞有关。

综上所述，XPO1在多种人胰腺癌细胞株中呈高表达，其异常高表达或与胰腺癌的发生、发展密切相关。XPO1新型抑制剂KPT-330可下调胰腺癌细胞中的XPO1表达，调节细胞周期分布，诱导细胞凋亡，抑制细胞增殖。后续拟继续开展相关体内实验以验证XPO1抑制剂抑制胰腺癌发生、发展、转移的作用并探讨其具体作用机制。

图4 KPT-330对MIA PaCa-2细胞细胞周期的影响