TLR4/NF-κB信号通路分子在胃癌中的表达及其与胃癌临床病理特征的相关性*

贺　娜　胡辉歌　麻　婧　钱美睿　曹　莹　吴开春&

陕西省榆林市星元医院消化内科1 (719000)　第四军医大学西京消化病医院　肿瘤生物学国家重点实验室2

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，在全球癌症死因中居第二位[1]，我国胃癌发病率和死亡率在恶性肿瘤中均居第三位，新发病例数占全球新发病例总数的42%[2]。胃癌是一种多步骤、多因素参与的病理过程，除环境和遗传因素外，免疫相关致病因素成为近年该领域的研究热点。Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)是存在于哺乳动物细胞表面的跨膜受体，在天然免疫中发挥重要作用。TLR4可识别病原体相关分子模式(PAMPs)和损伤相关分子 模式(DAMPs)，主要通过髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88, MyD88)依赖性途径将信号转导至细胞内，激活核因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)等核转录因子，引起多种细胞因子、趋化因子等效应分子释放，在免疫炎症反应中起重要调节作用，并可通过促进肿瘤细胞免疫逃逸、促增殖等多种机制参与恶性肿瘤的发生[3-8]。然而目前关于TLR4/NF-κB信号通路在胃癌中作用的研究较少。本研究通过检测胃癌组织中TLR4、MyD88、NF-κB的表达情况并分析其与胃癌临床病理特征的关系，以期明确TLR4/NF-κB信号通路在胃癌中的作用，从而为胃癌治疗和预后评估提供新思路。

材料与方法

一、标本来源

收集第四军医大学西京消化病医院2014年1月—2016年10月内镜活检和外科手术切除胃癌病理标本154例，胃癌诊断和幽门螺杆菌(Hp)感染状态均经病理科医师确认。标本来源病例中男性89例，女性65例，年龄19～76岁，平均(51.62±6.52)岁，患者术前未接受任何肿瘤相关治疗，无长期服用非甾体消炎药、皮质激素药物史，临床病理资料完整无缺失。将入组胃癌病理标本按有无Hp感染分为Hp阳性组(n=92)和Hp阴性组(n=62)，两组间性别、年龄、肿瘤分化程度、TNM分期等基线资料差异无统计学意义(P>0.05)。研究方案经医院伦理委员会审核批准，入组患者均知情同意。

二、方法

1．Hp感染检测：胃癌组织病理蜡块分别行HE染色、甲苯胺蓝染色和Warthin-Starry银染色检测Hp感染状态，3种方法中有2种及以上提示Hp阳性判定为Hp(+)，3种方法均提示Hp阴性判定为Hp(-)，仅一种方法提示Hp阳性的病例予以剔除。

2. Real-time PCR检测TLR4/NF-κB信号通路相关分子表达：以TRIzol试剂(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)提取胃癌组织总RNA，逆转录合成cDNA，以之为模板行real-time PCR扩增(相关试剂均为Takara Bio Inc.产品)，TLR4、MyD88、NF-κB、GAPDH(内参)引物序列见表1，序列均经NCBI BLAST软件验证，由华大基因股份有限公司合成。以非萎缩性胃炎患者的胃黏膜组织作为阴性对照。使用Applied Biosystems 7500快速实时荧光定量PCR系统(Thermo Fisher Scientific)行PCR扩增，反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，45个循环；熔解曲线65～95 ℃。2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1　Real-time PCR引物序列

三、统计学分析

结　　果

一、Hp阳性与阴性胃癌组织TLR4/NF-κB信号通路相关分子表达

Real-time PCR检测显示，Hp阳性组胃癌组织中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量均明显高于Hp阴性组，差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

组别例数TLR4mRNAMyD88mRNANF-κBmRNAHp阳性92187.58±43.15182.54±17.84154.73±17.95Hp阴性62102.98±24.0487.83±11.74102.84±12.85t值21.87418

二、TLR4/NF-κB信号通路相关分子表达与胃癌临床病理特征的关系

不同性别、年龄胃癌组织间TLR4、MyD88、NF-κB mRNA相对表达量差异均无统计学意义(P>0.05)，分化较差(未分化或低分化)、有远处转移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例胃癌组织中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达分别明显高于分化较好(高、中分化)、无远处转移和TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者，差异均有统计学意义(P<0.05)(表3)。

三、胃癌组织中TLR4、MyD88、NF-κB表达的相关性

Spearman相关系数分析显示，TLR4、MyD88、NF-κB mRNA在胃癌组织中的表达水平两两之间呈显著正相关(P<0.05)，相关系数分别为0.734(TLR4与MyD88)、0.657(TLR4与NF-κB)和0.828(MyD88与NF-κB)。

讨　　论

TLRs是一类天然免疫受体家族，其相关信号通路在炎症和免疫调节中发挥重要作用。细胞表面的TLRs识别PAMPs或DAMPs，刺激细胞因子生成，上调抗原呈递细胞(APCs)中的共刺激分子表达并活化T细胞，是连接天然免疫与获得性免疫的桥梁[3-4]。尽管已有大量研究证实TLR4信号通路过度激活与胃癌、肺癌、肝细胞癌、宫颈癌等多种恶性肿瘤的发生有关[4-7]，但对TLR4/NF-κB信号通路在胃癌发病机制中的作用尚无定论，其既可能通过增强早期抗肿瘤免疫发挥肿瘤抑制作用，亦可参与促进肿瘤免疫逃逸，或诱导对抗肿瘤药物的耐药性，从而促进肿瘤进展[8]。本研究首先对Hp阳性与阴性胃癌组织中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达进行了比较，结果显示Hp感染患者的胃癌组织中，上述分子相对表达量均显著高于Hp阴性胃癌患者，推测Hp在胃黏膜定植后，菌体成分如脂多糖、CagA等可能通过TLR4/NF-κB信号通路启动一系列炎症级联反应，诱导多种炎症因子释放，最终导致炎症微环境转变为炎症相关肿瘤微环境，促使胃黏膜发生恶性转化[9]。研究[10]证实TLR4对Hp的识别在Hp感染相关免疫炎症反应中起重要作用，可通过影响炎症性和调节性T细胞应答，促进慢性感染持续存在。由此可见，TLR4信号通路是Hp感染相关胃癌发病的重要环节。

表3　TLR4、MyD88、NF-κB表达与胃癌临床病理特征的关系

a与高-中分化组比较，P<0.05；b与无远处转移组比较，P<0.05；c与TNM Ⅰ+Ⅱ期组比较，P<0.05

为明确TLR4/NF-κB信号通路在胃癌进展中的作用，本研究进一步分析了该信号通路相关分子表达与胃癌临床病理特征的关系，结果显示TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达与患者性别、年龄无明显相关性，而与肿瘤恶性行为显著相关，在恶性行为较严重的胃癌组织，即未分化或低分化、有远处转移以及TNM分期Ⅲ、Ⅳ期病例的胃癌组织中，三者表达均显著高于高-中分化、无远处转移以及TNM分期Ⅰ、Ⅱ期者，初步表明在胃癌进展过程中，多种肿瘤相关分子模式导致TLR4/NF-κB信号通路过度激活，进而介导下游信号通路反应，引起多种细胞因子如转化生长因子-β1(TGF-β1)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-2/9(MMP-2/9)等表达上调，此种“瀑布”式级联反应在促进炎症进展的同时协助构建肿瘤微环境，促进肿瘤细胞增殖、抑制其凋亡，并增强其侵袭、转移等恶性潜能。本研究相关性分析显示胃癌组织中的TLR4、MyD88、NF-κB mRNA表达两两之间呈显著正相关，进一步证实胃癌组织中存在TLR4/NF-κB信号通路激活。NF-κB经TLR4转导至胞内的信号激活后发生核转位，其下游靶基因如抗凋亡因子TGF-β1等的转录、表达上调，又可促进NF-κB核转位而提高其转录活性[11]，进一步强化下游级联反应。

综上所述，本研究确认了TLR4/NF-κB信号通路可能在胃癌中起促进肿瘤进展的作用，并与Hp感染相关胃癌的发生有密切联系。该信号通路相关分子检测可能成为胃癌预后判断的参考指标，而对此信号通路的干预能否影响其下游基因转录，从而达到抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭能力、阻止肿瘤血管生成等潜在恶性行为的目的，仍有待进一步深入研究。

1 Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011, 61 (2): 69-90.

2 Chen WQ, Zheng RS, Zhang SW, et al.The incidences and mortalities of major cancers in China, 2010[J]. Chin J Cancer, 2014, 33 (8): 402-405.

3 Takeda K, Akira S. Toll-like receptors in innate immunity[J]. Int Immunol, 2005, 17 (1): 1-14.

4 王天轶，王军民，姚希贤. Toll样受体配体与胃肠道疾病[J]. 国外医学·消化系疾病分册, 2005, 25 (2): 100-103.

5 He W, Liu Q, Wang L, et al. TLR4 signaling promotes immune escape of human lung cancer cells by inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance[J]. Mol Immunol, 2007, 44 (11): 2850-2859.

6 李航宇，孙宏治，李岩，等. TLR2和TLR4在肝细胞癌中的表达及其与增殖效应因子之间的关系[J]. 中国现代医学杂志, 2014, 24 (27): 1-8.

7 王玎，李志英，卢娇. 高危型HPV阳性子宫颈癌组织和细胞株中TLR4/iNOS通路分子的表达及意义[J]. 海南医学院学报, 2016, 22 (1): 20-23,26.

8 Huang B, Zhao J, Li H, et al. Toll-like receptors on tumor cells facilitate evasion of immune surveillance[J]. Cancer Res, 2005, 65 (12): 5009-5014.

9 Mantovani A, Allavena P, Sica A, et al. Cancer-related inflammation[J]. Nature, 2008, 454 (7203): 436-444.

10Käbisch R, Mejías-Luque R, Gerhard M, et al. Involvement of Toll-like receptors onHelicobacterpylori-induced immunity[J]. PLoS One, 2014, 9 (8): e104804.

11Zhu Y, Culmsee C, Klumpp S, et al. Neuroprotection by transforming growth factor-beta1 involves activation of nuclear factor-kappaB through phosphatidylinositol-3-OH kinase/Akt and mitogen-activated protein kinase-extracellular-signal regulated kinase1,2 signaling pathways[J]. Neuroscience, 2004, 123 (4): 897-906.