Kupffer细胞极化和肝星状细胞活化在NAFLD相关炎症和纤维化中的作用*

王　祺　吴惠敏　倪茜茜　华　静

上海交通大学医学院附属仁济医院消化内科　上海市消化疾病研究所(200001)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一种除外乙醇和其他明确因素所致的以肝脏异常脂质沉积为主要特征的临床病理综合征，是与胰岛素抵抗、2型糖尿病、肥胖等密切相关的代谢性肝损伤[1]。NAFLD的疾病谱包括单纯性非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver, NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steato-hepatitis, NASH)、肝纤维化和肝硬化。Kupffer细胞和肝星状细胞(hepatic stellate cells, HSC)是肝内重要的非实质细胞，在慢性肝损伤炎症和纤维化的始动 和持续过程中发挥重要作用，然而，两者在NAFLD进展过程中表型和功能的改变与肝内炎症-纤维化的相关性尚不明确。本研究通过高脂饮食(high fat diet, HF饮食)和蛋氨酸胆碱缺乏饮食(methionine-choline deficient diet, MCD饮食)分别建立小鼠NAFL和NASH模型，观察Kupffer细胞极化和HSC活化在NAFLD进展中对肝内炎症-纤维化发展的影响。

材料与方法

一、实验动物和主要试剂

SPF级健康雄性8周龄C57BL/6小鼠，体质量18～22 g，由上海交通大学医学院附属仁济医院实验动物中心提供。

普通饮食、HF饮食、MCD饮食(Research Diets, Inc.)；大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体(GeneTex Inc.)；兔抗小鼠CD11c多克隆抗体(OriGene Technologies, Inc.)；兔抗小鼠CD206多克隆抗体、兔抗小鼠α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)单克隆抗体(Abcam plc.)；HRP标记免疫组化二抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)；TRIzolTM试剂(Invitro-genTM, Thermo Fisher Scientific)；real-time PCR试剂盒(Takara Bio Inc.)；PCR引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

二、方法

1. 实验动物分组和造模：C57BL/6小鼠随机分为正常对照(normal control, NC)组、HF组MCD组，每组5只，分别予普通饮食12周、HF饮食12周和MCD饮食8周喂饲。造模结束后颈椎脱臼法处死，取肝脏组织用于后续检测。

2. 肝脏组织病理学检查：肝组织标本4%甲醛固定，石蜡包埋、切片，行HE和Masson染色。HE染色切片光学显微镜下随机选取5个200倍视野，参照亚太地区NAFLD评估和处理指南中的评分标准评估 NAFLD活动度积分(NAFLD activity score, NAS)[2]。①肝细胞脂肪变：<5%，0分；5%～33%，1分；34%～66%，2分；>66%，3分。②小叶内炎症(20倍镜计数坏死灶)：无，0分；<2个，1分；2～4个，2分；>4个，3分。③肝细胞气球样变：无，0分；少见，1分；多见，2分。NAS总分0～8分，>4分诊断为NASH。Masson染色观察纤维组织增生情况，NASH可伴有纤维化。肝细胞脂肪变>33%且不伴有小叶内炎症、肝细胞气球样变和纤维化者为NAFL。

3. 肝组织免疫组化染色：肝组织切片烤片，脱蜡、水化，3% H2O2消除内源性过氧化物酶活性，柠檬酸盐溶液高压抗原修复，正常非免疫山羊血清封闭，分别滴加大鼠抗小鼠F4/80单克隆抗体(1∶50)、兔抗小鼠CD11c多克隆抗体(1∶50)、兔抗小鼠CD206多克隆抗体(1∶100)、兔抗小鼠α-SMA单克隆抗体(1∶300)，4 ℃孵育过夜，复温，滴加HRP标记二抗，DAB显色，苏木精复染，晾干，封片，光学显微镜下观察。随机选取5个200倍视野，计数阳性细胞，计算每视野阳性细胞均值。

4. 肝组织real-time PCR：取少量冻存肝组织，研磨后以TRIzolTM试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，以之为模板行real-time PCR扩增，检测炎症、纤维化相关基因[肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、转化生长因子-β1(TGF-β1)、α-SMA、Ⅰ 型胶原蛋白(Col1)]和过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)表达。目的基因引物序列见表1。PCR反应条件：95 ℃预变性30 s; 95 ℃变性5 s, 60 ℃退火30 s，40个循环。2-△△CT法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1　PCR引物序列

三、统计学分析

结　　果

一、NAFL和NASH的肝脏组织病理学变化

HE染色显示HF组小鼠肝组织内见大量空泡样脂肪变性细胞(>33%)，但未见明显小叶内炎性细胞浸润和肝细胞气球样变，Masson染色未见纤维组织增生；MCD组小鼠肝组织内见弥漫空泡样脂肪变性细胞(>66%)，伴有明显小叶内炎性细胞浸润(>4个坏死灶)，可见少量肝细胞气球样变，Masson染色见窦周和静脉周围较多纤维组织增生，NAS评分均>4分(图1)。上述发现提示HF饮食和MCD饮食分别诱导NAFL模型和NASH模型成功。

二、NAFL和NASH时肝内Kupffer细胞极化和HSC活化情况

免疫组化染色显示，HF组(NAFL)和MCD组(NASH)小鼠肝内F4/80阳性Kupffer细胞较NC组明显增加，且以CD11c阳性M1型巨噬细胞增加为主，差异均有统计学意义(P<0.05)；MCD组上述改变较HF组更为显著(P<0.05)。两组均未检测到明显CD206阳性M2型巨噬细胞。HF组和MCD组小鼠肝内α-SMA阳性HSC较NC组明显增加，MCD组较HF组增加更为显著，差异均有统计学意义(P<0.05)(图2)。

三、NAFL和NASH时肝内炎症、纤维化相关基因表达变化

Real-time PCR结果显示，HF组(NAFL)和MCD组(NASH)小鼠肝内TNF-α、TGF-β1 mRNA相对表达量较NC组明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)；肝内α-SMA、Col1 mRNA相对表达量增高仅在MCD组中差异有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图1　小鼠NAFL和NASH模型肝脏组织病理学变化(×200)

两组间比较，*P<0.05，**P<0.01

两组间比较，*P<0.05，**P<0.01

四、NAFL和NASH时肝内PPAR-γ基因表达变化

Real-time PCR结果显示，HF组(NAFL)小鼠肝内PPAR-γ mRNA相对表达量明显高于NC组，MCD组(NASH)小鼠肝内PPAR-γ mRNA相对表达量明显低于NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)(图4)。

两组间比较，*P<0.05，**P<0.01

讨　　论

在NAFLD进展的疾病谱中，NASH是最关键的病理环节，可进一步发展为肝纤维化、肝硬化。晚近研究显示天然免疫在NAFLD发病中发挥重要作用，免疫调控失败或障碍所致的免疫-炎症相关信号通路活化可能是启动和促进NAFL向NASH甚至肝纤维化进展的关键因素[3]。Kupffer细胞是定居于肝脏的机体内最大的巨噬细胞群，其活化后不仅可释放多种促炎细胞因子、趋化因子，还调控着周围细胞的表型和功能，尤其是Kupffer细胞与其他细胞间的相互作用可影响疾病进程。HSC表型由静息型转变为活化增殖型是肝纤维化形成和进展的中心 环节。作为肝脏内两种重要的非实质细胞，Kupffer细胞与HSC间的交互作用可能在慢性肝损伤炎症和纤维化的始动和持续过程中发挥重要作用。

巨噬细胞具有高度异质性和可塑性，在不同微环境信号的作用下发生不同方向的极化，从而具有不同表型和功能。M1型巨噬细胞发挥促炎、抗增殖、介导组织损伤作用，M2型巨噬细胞则发挥抑制炎症、促进组织修复和重塑作用[4-5]。既往动物实验研究[6]发现，C57BL/6小鼠NASH的发生常伴随肝内M1/M2型巨噬细胞比值增高。本研究结果显示，HF饮食诱导的C57BL/6小鼠NAFL模型肝内Kupffer细胞和M1型巨噬细胞均显著增加，尽管未见明显小叶内炎性细胞浸润，但促炎细胞因子TNF-α表达增高。MCD饮食诱导的小鼠NASH模型肝内Kupffer细胞和M1型巨噬细胞与NAFL时相比进一步增加，伴随明显炎性细胞浸润和TNF-α表达增高。上述发现提示HF饮食诱导的肝内Kupffer细胞M1型极化与NAFL时的肝内低度炎症有关；而在NASH阶段，肝内炎症加重不仅与Kupffer细胞M1型极化有关，还与肝内炎症细胞募集有关。

HSC是肝组织损伤后修复时产生细胞外基质的主要细胞。生理条件下，HSC处于静息状态，调控细胞外基质稳态；肝脏损伤时，炎症细胞释放的促纤维化因子激活HSC，使其出现特征性的形态和功能转变，转化为具有增殖、收缩功能的肌成纤维样细胞，能合成大量胶原纤维，致使大量细胞外基质和纤维组织形成[7]。目前研究认为，巨噬细胞可通过分泌TGF-β1等促纤维化因子激活HSC[8]。本研究发现，小鼠NAFL模型肝内促纤维化因子TGF-β1表达已较正常饮食小鼠明显增高，且免疫组化染色可见肝内α-SMA阳性细胞(活化HSC)明显增加，同时肝内α-SMA mRNA表达有所增高，但未见Col1表达明显增高。而小鼠NASH模型肝内TGF-β1和Col1表达均明显增高，伴有更显著的HSC活化，Masson染色见窦周和静脉周围较多纤维组织形成。由此推测NAFLD发展过程中肝纤维化的启动可能始于NAFL阶段，以Kupffer细胞M1型极化为核心的局部天然免疫-炎症反应的持续活化可能启动了HSC的活化，但此种早期活化HSC的细胞功能尚未发生显著变化；至NASH阶段，Kupffer细胞亦或募集至肝脏的单核细胞源性巨噬细胞的促炎、促纤维化功能更加强大，从而进一步激活HSC，促进其发生表型和功能改变，推动炎症-纤维化进展。

PPAR-γ属于核激素受体超家族，是一种配体应答型转录因子，通过配体激活实现核转位而调节靶基因表达[9]。既往研究[10]证实，PPAR-γ是巨噬细胞极化的关键调节因子，可通过调控巨噬细胞的极化方向而影响机体炎症反应。本课题组前期研究[11]亦发现，上调PPAR-γ表达可使脂质诱导的巨噬细胞极化由M1型向M2型转移。PPAR-γ同样能影响HSC的活性状态，其表达上调能使HSC由活化增殖型转变为静息型[12]。因此，PPAR-γ表达水平可能与肝内炎症-纤维化程度密切相关。本研究发现小鼠NAFL模型肝内PPAR-γ表达显著增高，NASH模型肝内PPAR-γ表达则显著降低。笔者推测，尽管HF饮食可促进Kupffer细胞M1型极化和早期HSC活化，但肝内较高水平的PPAR-γ表达阻止了两者的进一步活化，因此NAFL阶段肝内仅有低度炎症反应；至NASH阶段，PPAR-γ表达显著下降可能促进巨噬细胞/Kupffer细胞的M1型极化并使HSC不断活化，导致炎症-纤维化反应加剧，促进疾病进展。

综上所述，在NAFLD进展过程中，肝内Kupffer细胞呈现持续的M1型极化，HSC在NAFLD早期已出现活化并随疾病由NAFL向NASH进展而加剧。Kupffer细胞极化和HSC活化促进了NAFLD中肝脏炎症-纤维化的启动和进展，抑制肝内Kupffer细胞M1型极化和HSC活化则可减轻炎症-纤维化。后续拟进一步研究NASH发展过程中Kupffer细胞和HSC的表型、功能改变以及两者间的交互作用，明确PPAR-γ对两者活化和交互作用的影响，从而设计基于细胞特异性和病程阶段性的调控治疗靶点，为NAFLD的预防和治疗提供新思路。

1 Yeh MM, Brunt EM. Pathological features of fatty liver disease[J]. Gastroenterology, 2014, 147 (4): 754-764.

2 Farrell GC, Chitturi S, Lau GK, et al; Asia-Pacific Working Party on NAFLD. Guidelines for the assessment and management of non-alcoholic fatty liver disease in the Asia-Pacific region: executive summary[J]. J Gastro-enterol Hepatol, 2007, 22 (6): 775-777.

3 Arrese M, Cabrera D, Kalergis AM, et al. Innate Immunity and Inflammation in NAFLD/NASH[J]. Dig Dis Sci, 2016, 61 (5): 1294-1303.

4 Mosser DM, Edwards JP. Exploring the full spectrum of macrophage activation[J]. Nat Rev Immunol, 2008, 8 (12): 958-969.

5 Laskin DL, Sunil VR, Gardner CR, et al. Macrophages and tissue injury: agents of defense or destruction?[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 2011, 51: 267-288.

6 Maina V, Sutti S, Locatelli I, et al. Bias in macrophage activation pattern influences non-alcoholic steatohepatitis (NASH) in mice[J]. Clin Sci (Lond), 2012, 122 (11): 545-553.

7 Trautwein C, Friedman SL, Schuppan D, et al. Hepatic fibrosis: Concept to treatment[J]. J Hepatol, 2015, 62 (1 Suppl): S15-S24.

8 Tsuchida T, Friedman SL. Mechanisms of hepatic stellate cell activation[J]. Nat Rev Gastroenterol Hepatol, 2017, 14 (7): 397-411.

9 Lehrke M, Lazar MA. The many faces of PPARgamma[J]. Cell, 2005, 123 (6): 993-999.

10Odegaard JI, Ricardo-Gonzalez RR, Goforth MH, et al. Macrophage-specific PPARgamma controls alternative activ-ation and improves insulin resistance[J]. Nature, 2007, 447 (7148): 1116-1120.

11Luo W, Xu Q, Wang Q, et al. Effect of modulation of PPAR-γ activity on Kupffer cells M1/M2 polarization in the development of non-alcoholic fatty liver disease[J]. Sci Rep, 2017, 7: 44612.

12Yang MD, Chiang YM, Higashiyama R, et al. Rosmarinic acid and baicalin epigenetically derepress peroxisomal proliferator-activated receptor γ in hepatic stellate cells for their antifibrotic effect[J]. Hepatology, 2012, 55 (4): 1271-1281.