TIPE2在溃疡性结肠炎中的表达及其意义探究*

王　沫　董　蕾　赵菊辉　刘　欣

西安交通大学第二附属医院消化内科(710004)

肿瘤坏死因子-α诱导蛋白8样2(tumor necrosis factor-α-induced protein 8-like 2, TNFAIP8L2, TIPE2)于2008年在小鼠自身免疫性脑脊髓炎动物模型中首次被筛选鉴定[1]，其高表达于小鼠免疫组织和免疫器官，在人体中则广泛表达于各类组织和器官中[2]。大量实验研究表明TIPE2在先天免疫和获得性免疫中起重要负性调控作用，对于维持免疫稳态和免疫耐受具有重要意义[1]。溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)为消化系统常见病，是一种多因素参与的以免疫紊乱为特征的复发性肠道慢性炎症性疾病，其病因和发病机制尚未完全明确，根治困难，易反复发作。TIPE2作为重要的免疫负调控蛋白，可能参与了UC的发生、发展过程。本研究通过检测TIPE2在UC患者外周血和结肠黏膜中的表达情况，并与非UC个体进行对比，旨在探讨TIPE2在UC 发生、发展中的作用。

材料与方法

一、标本来源

收集2015年1月—2016年8月就诊于西安交通大学第二附属医院的活动期UC患者的外周血标本42例和结肠黏膜标本30例。入组患者UC均经临床表现、内镜特征和组织病理学检查结果确诊。收集同期消化道息肉患者外周血标本15例和健康体检者、结肠息肉术后复诊、痔疮等非UC患者的结肠黏膜标本13例作为对照。采集入组UC患者的临床资料，包括一般资料、病史、血常规、超敏C反应蛋白(hsCRP)、红细胞沉降率(ESR)等。研究方案经医院伦理委员会审核批准，入组者对外周血和结肠黏膜标本采集均知情同意。

二、主要试剂

TRIzol试剂(Thermo Fisher Scientific)；Prime-ScriptTMRT Master Mix(Perfect Real Time)、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(Takara Bio Inc.)；兔抗人TIPE2多克隆抗体(Abcam plc.)；山羊抗兔二抗(武汉博士德生物工程有限公司)；免疫组化SP试剂盒(西安赫特生物科技有限公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：受检者留取静脉血5 mL，使用淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞(PBMC)。TRIzol试剂提取PBMC总RNA，以PrimeScriptTMRT Master Mix逆转录合成cDNA，取 2 μL 逆转录产物，以TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 行real-time PCR扩增。PCR引物序列：TIPE2，F 5’-GGC ACT TAG CTT TGG TGA GG-3’, R 5’-TGA GTG AAG TCA GGC CCA TA-3’，扩增产物198 bp；GAPDH(内参)，F 5’-CTC CTC CAC CTT TGA CGC TG-3’, R 5’-TCC TCT TGT GCT CTT GCT GG-3’，扩增产物279 bp。TIPE2反应条件：95 ℃预变性 30 s；95 ℃ 3 s, 60 ℃ 30 s，共40个循环，熔解曲线95 ℃ 15 s， 60 ℃ 60 s, 95 ℃ 15 s。以2-△△CT法计算TIPE2 mRNA相对表达量。每一样本独立重复实验3次。

2. 免疫组化染色：结肠标本以40 g/L甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，4 μm厚度连续切片；切片常规脱蜡水化，枸橼酸盐高温修复抗原。按试剂盒说明书进行操作，行SP法免疫组化染色，以PBS代替一抗作为阴性对照。光学显微镜下阅片，每张切片于400倍视野下随机采集3张图像，Image-Pro Plus软件定量分析TIPE2蛋白相对表达量，以平均光密度值(MOD值)表示。

四、统计学分析

结　　果

一、一般资料

采集外周血标本的42例UC患者根据True-love-Witts分型标准[3]，轻度15例，中度15例，重度12例。采集结肠标本的30例UC患者根据UC疾病活动度内镜和组织学分级标准[3]，轻度8例，中度12例，重度10例。外周血标本UC组、结肠标本UC组与相应对照组间、不同严重程度外周血标本或结肠标本UC组间性别构成、平均年龄差异均无统计学意义(P>0.05)(表1、表2)。

表1　采集外周血标本UC患者一般资料

与对照组比较，*P=0.808,△P=0.240

表2　采集结肠标本UC患者一般资料

与对照组比较，*P=0.370,△P=0.205

二、采集外周血标本UC患者外周血炎症指标比较

Truelove-Witts分型轻、中、重度UC组间外周血中性粒细胞百分比(NEUT%)、hsCRP、ESR差异均有统计学意义(P=0.035;P=1.83×10-4;P=0.006)。重度UC组NEUT%明显高于轻度UC组；轻、中、重度UC组hsCRP随病情加重呈上升趋势；轻度UC组ESR明显低于中、重度UC组(图1)。

三、外周血TIPE2 mRNA表达

Real-time PCR结果显示，UC组外周血TIPE2 mRNA相对表达量较对照组有增高趋势，但差异无统计学意义(P=0.625)。Truelove-Witts分型轻、中、重度UC组中，中度组TIPE2 mRNA表达最高，重度组次之，轻度组最低，但总体差异无统计学意义(P=0.969)(图2)。分别以NEUT%、hsCRP、ESR的正常参考值为界值进行分组，比较不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC组间的TIPE2 mRNA表达差异，结果显示组间差异均无统计学意义(P=0.796;P=0.250;P=0.328)(图3)。

四、结肠黏膜TIPE2蛋白表达

免疫组化染色结果显示，UC组结肠黏膜TIPE2蛋白表达MOD值明显高于对照组，差异有统计学意义(P=1×10-6)。在组织学分级轻、中、重度UC组中， MOD值随组织学分级的升高而升高，但总体差异无统计学意义(P=0.485)(图4)。

图2　UC患者外周血TIPE2 mRNA表达(real-time PCR)

讨　　论

正常人肠道中有黏膜上皮屏障和先天免疫、获得性免疫两道屏障。UC时，这两道屏障功能出现异常，无法抵御肠道微生物的侵袭。肠道微生物与黏膜免疫系统之间的相互作用失调导致效应T细胞过度反应，各类免疫细胞释放大量炎症因子长期作用于肠黏膜，导致炎症反应发生。研究发现免疫负调控蛋白TIPE2可通过调节Toll样受体(TLR)、T细胞受体(TCR)、NF-κB、JNK、p38 MAPK、TAK1、Rac、 PI3K-AKT等信号通路实现对T细胞、 巨噬细胞、树突细胞等免疫细胞的负性调控，从而下调促炎细胞因子表达，抑制免疫炎症反应[1,4-7]。同时，TIPE2还可促进M2型巨噬细胞分化[7]，并在调节性T细胞(Treg细胞)的免疫抑制功能中发挥重要作用[8]。但迄今为止，关于TIPE2在人类免疫炎症相关疾病中作用的研究并不太多。既往研究显示，TIPE2在免疫性疾病如系统性红斑狼疮、哮喘患者PBMC中的表达显著降低[9-10]，乙型肝炎和原发性胆汁性肝硬化患者亦存在PBMC中TIPE2表达降低，并与血清转氨酶水平呈显著负相关[11-12]；但在强直性脊柱炎患者的外周血和糖尿病性肾病患者的肾脏组织中，TIPE2却呈高表达[13-14]。上述TIPE2在不同疾病中差异表达的现象有待解释，其发挥免疫负调节作用的具体机制尚需进一步研究予以揭示。

图1　采集外周血标本UC患者轻、中、重度组间外周血炎症指标比较

图3　不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC组间外周血TIPE2 mRNA表达比较

A、C：对照组结肠黏膜中几乎无TIPE2表达(A：×200，C：×400)；B：UC结肠黏膜中TIPE2表达阳性，腺上皮细胞和浸润炎性细胞中均有TIPE2表达(×200)；D：轻度UC结肠黏膜中TIPE2弱阳性表达，腺上皮细胞和浸润炎性细胞中均有TIPE2表达(×400)；E、F：中度UC结肠黏膜中TIPE2中等阳性表达，腺上皮细胞和浸润炎性细胞中均有TIPE2表达(×400)；G：重度UC结肠黏膜中TIPE2强阳性表达(×400)；H：重度UC增生淋巴组织中TIPE2强阳性表达，表达定位于细胞质(×400)

图4不同组织学分级UC结肠黏膜TIPE2蛋白表达(免疫组化SP法)

本研究以活动期UC患者为研究对象，分别采集其外周血和结肠黏膜标本，并收集一般资料、病史、外周血炎症指标等信息，分别按Truelove-Witts分型和组织学分级将患者分为轻、中、重度三组，采用real-time PCR和免疫组化染色检测PBMC和结肠黏膜中的TIPE2表达。结果显示UC组结肠黏膜TIPE2蛋白表达显著高于对照组，在轻、中、重度组织学分级组间，其表达呈逐渐增高趋势，但总体差异无统计学意义，可能与样本量较小有关。上述发现提示TIPE2表达可能与UC发生、发展相关。

本研究采集外周血标本UC患者分组所使用的Truelove-Witts分型标准中不包括NEUT%和hsCRP两项指标，故对这两项指标在不同严重程度UC组间的表达进行了比较，结果显示不同严重程度UC组间hsCRP差异显著，其水平随病情加重逐渐升高，提示hsCRP能较好地反映UC病情严重程度。Real-time PCR结果显示，UC组外周血TIPE2 mRNA表达虽较对照组有所升高，但差异无统计学意义，轻、中、重度组间总体差异亦无统计学意义。进一步比较不同NEUT%、hsCRP、ESR水平UC组间的TIPE2 mRNA表达差异，亦均未达统计学意义。关于TIPE2在结肠黏膜与外周血中的表达水平不一致的原因，可能有以下几点。首先，各个生物学指标在血液和组织中的表达水平以及检测技术的敏感性本身就存在差异。其次，本研究对采集外周血患者的分组依据是以临床症状和实验室指标为基础的Truelove-Witts分型标准，而炎症性肠病常存在内镜表现与临床表现不平行的情况，也是造成该现象的可能原因之一。第三，样本采集过程中由于各种客观因素，采集结肠黏膜标本的患者与采集外周血标本的患者几乎无重叠，可能在一定程度上影响实验结果。此外，由于我国UC患病率不高，短时间内难以获取足量样本，样本量不足同样会造成实验结果的偏倚。最后，本研究样本来源病例几乎未涉及初发患者，入组患者或多或少接受过不同形式和程度的治疗，因此检测结果可能不能准确反映UC自然病程下的TIPE2表达情况。如不受治疗干扰，TIPE2可能会更大程度地在结肠局部参与UC疾病进程。

结肠局部TIPE2表达增高可能是免疫系统的负反馈调节，也可能是免疫功能失调的表现，其表达增高可抑制免疫系统对细菌等病原体的防御能力，病原体侵袭使黏膜破坏进一步加重。有研究[15]以葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导小鼠急性结肠炎模型，发现TIPE2-/-小鼠结肠炎症和损伤均明显减轻，炎性细胞浸润减少，促炎细胞因子表达显著降低，深究TIPE2-/-小鼠抵抗DSS诱导的结肠炎的原因，可能与结肠局部共生细菌播散受抑和系统性炎症减轻有关，证实TIPE2对抗菌免疫起负向调控作用。

综上所述，UC患者结肠局部TIPE2表达增高，其可能通过免疫负调控作用抑制炎症反应以及抑制抗菌免疫参与UC的发生、发展。TIPE2在UC中的具体作用机制仍有待进一步研究证实。

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