天麻素对焦虑样胃高敏感FD模型大鼠胃敏感性和焦虑样行为的影响

景富春 张 军 王进海 冯 诚 杨宝德 胡 浩, 孙晓明 郑建云 尹晓然 年媛媛

西安交通大学第二附属医院消化内科1(710004) 延安大学附属宝鸡市人民医院消化内科2西安交通大学医学部药理学系3 西安交通大学医学部基础医学实验教学中心4西安医学院第一附属医院病理科5

天麻素对焦虑样胃高敏感FD模型大鼠胃敏感性和焦虑样行为的影响

景富春1,2*张 军1#王进海1冯 诚1杨宝德3胡 浩3,4孙晓明4郑建云5尹晓然1年媛媛1

西安交通大学第二附属医院消化内科1(710004)延安大学附属宝鸡市人民医院消化内科2西安交通大学医学部药理学系3西安交通大学医学部基础医学实验教学中心4西安医学院第一附属医院病理科5

伴焦虑症状并以胃高敏感为主的功能性消化不良(FD)是临床治疗的难点之一，天麻素(Gas)可能具有调节胃敏感性和焦虑样行为的双重作用。目的探讨Gas对焦虑样胃高敏感FD模型大鼠胃敏感性和焦虑样行为的影响。方法将40只新生幼鼠随机分为对照组、模型组、丁螺环酮组、Gas低剂量组和Gas高剂量组。序贯采用母婴分离、急性胃刺激和束缚应激法制作焦虑样胃高敏感大鼠模型。第8周，对照组和模型组大鼠腹腔注射0.9% NaCl溶液2.0 mL/kg，丁螺环酮组给予丁螺环酮3.125 mg/kg，Gas低、高剂量组分别给予62.5 mg/kg和125.0 mg/kg Gas，连续7 d。末次给药后行高架十字迷宫(EPM)试验、旷场试验、腹壁回撤反射(AWR)和肌电图(EMG)。结果与对照组相比，EPM试验示模型组大鼠进入开放臂次数的比例、开放臂停留时间的比例均显著降低(P<0.01)，旷场试验示虚拟中央格停留时间明显缩短(P<0.05)、穿行格数和直立次数明显减少(P<0.01)；胃气囊扩张压力为40 mm Hg或以上时，AWR评分显著升高(P<0.05)，EMG的ROC曲线下面积(AUC)明显增加(P<0.01)。而与模型组相比，高、低剂量Gas均可明显改善上述指标(P<0.05)。结论Gas对焦虑样胃高敏感FD模型大鼠脑-胃轴调节中胃敏感性和焦虑样行为具有明显的影响。

天麻素； 焦虑； 胃高敏感； 消化不良

功能性消化不良(functional dyspepsia, FD)以反复发作的餐后饱胀不适、早饱不适、中上腹痛等为主要表现，常伴焦虑、抑郁等精神心理症状而又缺乏胃肠和神经系统的器质性病变。脑-胃肠轴的互动调节以及精神心理障碍在FD发病中占有极其重要的地位，是目前诊治的主要方向[1]。但目前对脑-肠轴的关注甚多，对脑-胃轴的研究少见。从脑-胃轴与精神心理和药物作用之间的关系来看，一方面胃敏感性增高是FD疗效差且易于复发的重要原因，也是餐后上腹痛等症状的始动因素之一[2-3]。另一方面，焦虑、抑郁等精神心理症状可见于约40%～90%的FD患者中，对胃高敏感等的发生具有重要促进作用[4]。因此，通过改善焦虑症状或降低胃敏感性，均有可能产生抗FD作用。

天麻素(gastrodin, Gas)是中药天麻中的一种生物活性物质[5]，具有调节多种神经递质的作用，在精神心理障碍以及内脏感觉、运动感觉中发挥重要作用。本研究的前期临床观察[6]发现Gas对伴焦虑、抑郁症状的FD患者有一定治疗作用，但其是否通过同时改善焦虑和降低内脏敏感性起作用尚不清楚。本研究通过将Gas用于焦虑样胃高敏感FD大鼠模型，旨在探讨Gas对FD模型大鼠脑-胃轴调节中胃敏感性和焦虑样行为的影响，从而为阐明Gas药理多效性和抗FD治疗的机制提供一定依据。

材料与方法

一、实验动物、试剂仪器

1. 实验动物：雄性SPF级Sprague-Dawley(SD)幼鼠40只，体质量3～5 g，购自第四军医大学实验动物中心。母婴同笼饲养于西安交通大学医学部机能实验中心。

2. 主要试剂和仪器：碘乙酰胺购自上海麦克林生化科技有限公司，Gas购自昆明制药集团公司，丁螺环酮购自江苏恩华药业股份有限公司。PMT-100型大鼠高架十字迷宫(EPM)由成都泰盟科技有限公司生产。旷场试验装置为自制，箱高30 cm，底边长100 cm，底面平均分为5个20 cm×20 cm的虚拟小方格。大鼠束缚应激装置为自制的长15 cm、直径 6 cm的塑料圆筒，两端自由通气。生物机能实验系统为成都泰盟科技有限公司生产的BL-420S及其配套软件TM-WAVE。

二、动物分组和造模

1. 动物分组：将40只幼鼠随机分为5组：对照组、模型组、丁螺环酮组、Gas低剂量组和Gas高剂量组，每组8只。

2. 母婴分离法[7]：除对照组外，各组幼鼠自出生第2日起，每日与母鼠分离3 h(上午9:00～12:00)，第21日结束。对照组母婴同笼饲养。所有幼鼠自出生第22日断奶，并与母鼠完全分离。

3. 急性胃刺激法[8]：除对照组外，其余各组幼鼠于出生第10日起，每日采用含0.1%碘乙酰胺的2%蔗糖溶液0.2 mL灌胃，对照组仅用等容积2%蔗糖溶液灌胃，连续6 d。

4. 束缚应激法[9]：第8周，每日将大鼠放入束缚应激装置内，持续90 min后放回原笼，连续1周。

5. 给药：束缚应激试验结束后，对照组和模型组腹腔内注射等容积0.9% NaCl溶液2.0 mL/kg，Gas低剂量组和高剂量组分别腹腔注射62.5 mg/kg和125.0 mg/kg Gas，丁螺环酮组腹腔注射3.125 mg/kg丁螺环酮，连续7 d。

三、模型评价方法

1. EPM试验[10]：将大鼠置于EPM中央区、面向实验者对侧的开放臂，同时开启视频摄像追踪系统，计时5 min，记录大鼠进入开放臂和闭合臂的次数、停留时间。每只大鼠实验结束后将实验仪器四臂以10%乙醇清洁，消除不同动物气味的干扰。

2. 旷场试验[11]：将大鼠置于反应箱底部虚拟中央格处并立即开始计时，记录5 min内大鼠在中央格的停留时间、穿行格数、直立次数和修饰行为。每只大鼠试验结束后均用10%乙醇清洁反应箱内壁和底面，以消除上次动物粪便、气味的影响。

3. 胃气囊和电极植入术[12]：术前禁食一晚。大鼠腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥钠溶液进行麻醉，于左侧腹部切开，暴露胃，将固定于PE240导管的气囊插入胃内并确保无幽门梗阻。然后紧密结扎胃底切口以防胃液漏入腹腔。将消毒过的不锈钢电极线植入肩斜方肌(颈部表浅肌肉)，缝合切口。

4. 腹壁回撤反射(AWR)：气囊植入术后第6日行AWR，压力梯度定为20、40、60、80、100 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，每个压力持续20 s，间隔2 min[13]。参照Liu等[8]的研究，AWR评分标准为：0分，对胃扩张无行为反应；1分，简单头部运动；2分，腹肌收缩；3分，腹部抬高；4分，躯体弓形，骨盆抬高或身体扭伸。

5. 肌电图(EMG)[12]：采集基线数据，然后分别记录不同胃气囊充气压力梯度下的EMG，并将所获原始数据计算ROC曲线下面积(AUC)。

四、统计学分析

结 果

一、焦虑样行为变化

1. EPM试验：与对照组相比，模型组大鼠进入开放臂次数的比例、开放臂停留时间的比例均显著降低(P<0.05)，表明模型组大鼠表现出了焦虑样行为。而与模型组相比，Gas高、低剂量组大鼠上述两个指标均明显增加(P<0.05)；丁螺环酮组表现出与Gas类似的作用(P<0.05)(表1)。

2. 旷场试验：与对照组相比，模型组大鼠在中央格停留时间明显缩短(P<0.05)、穿行格数和直立次数明显减少(P<0.01)，但在修饰行为方面差异无统计学意义，提示模型组大鼠表现出了焦虑样行为，与EPM试验结果一致。而与模型组相比，Gas高、低剂量组大鼠在中央格停留时间明显延长、穿行格数和直立次数明显增加(P<0.05，P<0.01)；丁螺环酮组表现出与Gas类似的效应(P<0.05，P<0.01)(表2)。

二、胃敏感性变化

1. AWR：与对照组相比，扩张压力为40 mm Hg或以上时，模型组AWR评分显著升高(P<0.05，P<0.01)，表明大鼠对胃扩张刺激的敏感性明显增高。与模型组相比，扩张压力为40 mm Hg或以上时，Gas高、低剂量组AWR评分显著降低(P<0.05，P<0.01)。丁螺环酮具有类似的效果(P<0.05，P<0.01)(表3)。

2. EMG：与对照组相比，扩张压力为40 mm Hg或以上时，模型组肩斜方肌EMG的AUC显著增加(P<0.01)，表明大鼠对胃扩张刺激的敏感性明显增高。而与模型组相比，扩张压力为40 mm Hg或以上时，Gas高、低剂量组AUC显著降低(P<0.01)。丁螺环酮具有类似的效果(P<0.01)(表4)。

表1 各组大鼠EPM结果比较

*与对照组比较，P<0.05；#与模型组比较，P<0.05

讨 论

脑-胃肠轴的互动调节和精神心理障碍在FD发病中起有重要作用[1]。有研究表明胃敏感性增高是FD的主要发病机制之一，而焦虑、抑郁等精神心理障碍在FD患者中不仅发生率高，还促进了胃高敏感的发生和发展[3,14]，是FD难治和易于复发的重要原因。有鉴于此，寻找具有抗焦虑和降低胃敏感性的双重作用且对脑-胃轴有重要调节作用的抗FD药物是临床和基础研究的方向之一。

表2 各组大鼠旷场试验结果比较

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05,##P<0.01

表3 各组大鼠AWR评分比较

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01

表4 各组大鼠EMG的AUC比较

*与对照组比较，P<0.01；#与模型组比较，P<0.01

既往研究显示，Gas可调节大鼠纹状体内γ-氨基丁酸(GABA)[15]、脊髓中脑源性神经生长因子(BDNF)[13,16]和海马内5-羟色胺(5-HT)[17]等神经递质含量，而这些神经递质与脑-胃轴调节焦虑、抑郁等精神心理障碍以及内脏感觉等内脏功能调控密不可分。Gas对创伤后应激障碍所致大鼠焦虑样行为有改善作用[18]，对病理状态下出现的内脏痛等有镇痛作用[19-20]，本研究的前期临床观察[6]也发现Gas对伴焦虑、抑郁症状的FD患者有一定治疗作用。上述研究结果表明Gas可能具有抗焦虑和调节内脏感觉等作用，但其是否通过同时改善焦虑和降低内脏敏感性起作用尚不明确。

多项研究表明，幼年的不良生理或心理刺激以及成年后急性应激反应均参与了FD症状的形成[21-22]，而这些不良刺激也可同时引起动物成年后的焦虑样症状和行为[23-24]，影响成年动物的胃敏感性、摄食量和胃容受性舒张功能[8]。据此，本研究采用幼年时期给予母婴分离、急性胃刺激和成年后给予束缚应激来制作焦虑样胃高敏感大鼠FD模型，进而探讨Gas对模型大鼠胃敏感性和焦虑样行为的影响。结果显示，与对照组相比，模型组大鼠在EPM试验中向开放臂探索的次数和在开放臂停留的时间均明显减少，在旷场虚拟中央格停留的时间明显缩短、穿行格数明显减少，表明存在焦虑样行为，这一变化较好地模拟了FD患者在临床上易于出现的焦虑样症状。同时，模型组大鼠在胃气囊扩张压力达到40 mm Hg或以上时，AWR评分明显高于对照组，EMG法亦显示相同扩张压下AUC较对照组明显增加。说明模型组大鼠对胃扩张刺激的敏感性明显增加，这一变化较好地模拟了FD患者胃敏感性增高的特点。由此可见，本研究诱导的大鼠模型具备了部分FD患者胃敏感性增高和焦虑样行为的双重特点。与模型组相比，Gas高、低剂量组大鼠在EPM试验中进入开放臂的次数和在开放臂停留时间均明显增加，在旷场试验中于虚拟中央格停留时间明显延长、穿行格数和直立次数明显增加，提示Gas有一定的抗焦虑作用。胃气囊扩张压力达到40 mm Hg或以上时，Gas高、低剂量组大鼠AWR评分明显低于模型组，EMG的AUC亦明显降低，表明Gas具有明显降低大鼠对胃扩张刺激的敏感性作用。推测上述作用可能与其影响中枢和外周多种脑胃共有的神经调节因子有关。阳性药丁螺环酮具有与Gas类似的效果，验证了本模型和Gas药效学试验结果的可靠性。

综上所述，本研究采用焦虑样胃高敏感大鼠FD模型，初步探讨了Gas对FD大鼠脑-胃轴调节中胃敏感性和焦虑样行为的影响，结果表明Gas具有一定的抗焦虑和降低胃敏感性的作用，为阐明Gas的作用机制和从中药入手进行抗FD药物开发提供了新的视角，也为Gas用于伴焦虑症状的FD患者治疗奠定了一定的实验基础。

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EffectofGastrodinonGastricSensitivityandAnxiety-likeBehaviorinFDRatsWithAnxiety-likeGastricHypersensitivity

JINGFuchun1,2,ZHANGJun1,WANGJinhai1,FENGCheng1,YANGBaode3,HUHao3,4,SUNXiaoming4,ZHENGJianyun5,YINXiaoran1,NIANYuanyuan1.

1DepartmentofGastroenterology,theSecondAffiliatedHospitalofXianJiaotongUniversity,Xian(710004);2DepartmentofDigestiveDiseases,BaojiPeople’sHospitalAffiliatedtoYananUniversity,Baoji,ShaanxiProvince;3DepartmentofPharmacology,HealthScienceCenter,XianJiaotongUniversity,Xian;4BasicMedicalExperimentTeachingCenter,HealthScienceCenter,XianJiaotongUniversity,Xian;5DepartmentofPathology,theFirstAffiliatedHospitalofXianMedicalUniversity,Xian

ZHANG Jun, Email: jun3z@163.com

Background: Functional dyspepsia (FD) with anxiety and gastric hypersensitivity is still one of the therapeutic difficulties in clinic. Gastrodin (Gas) may have dual effects of modulating gastric sensitivity and anxiety.AimsTo investigate the effect of Gas on gastric sensitivity and anxiety-like behavior in FD with anxiety-like gastric hypersensitivity in rats.MethodsForty rats were randomly divided into control group, model group, buspirone group, low-dose Gas group and high-dose Gas group. Maternal separation, acute gastric irritation and restraint stress were sequentially performed to induce FD model with anxiety-like gastric hypersensitivity. At the 8thweek, rats in control group and model group were intraperitoneally injected with 0.9% NaCl solution 2.0 mL/kg, rats in buspirone group were given buspirone 3.125 mg/kg, and rats in low- and high-dose Gas groups were given 62.5, 125.0 mg/kg Gas, respectively. The course was 7 days. Then elevated plus maze (EPM), open field test, abdominal withdrawal reflex (AWR) and electromyography (EMG) were performed.ResultsCompared with control group, EPM test showed that proportions of open arms entries and duration were significantly decreased (P<0.01); open field test showed that virtual central grids duration (P<0.05), number of virtual grids climbed and times of lifting were significantly decreased (P<0.01)； when gastric balloon dilatation pressure was equal or greater than 40 mm Hg, AWR score, area under ROC curve (AUC) of EMG was significantly increased in model group (P<0.05). Compared with model group, above-mentioned indices in low- and high-dose Gas groups were significantly ameliorated (P<0.05).ConclusionsGas could influence the gastric sensitivity and anxiety-like behavior of the brain-stomach axis regulated anxiety-like gastric hypersensitivity in FD rat model.

Gastrodin; Anxiety; Gastric Hypersensitivity; Dyspepsia

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.12.006

*Email: fleming7798@163.com

#本文通信作者，Email: jun3z@163.com

(2017-06-12收稿；2017-07-21修回)