长链非编码RNA TUG1在胃癌患者中的表达及其对预后的影响

申 彤 司君利 崔京远 亓玉琴 吕 梅

青岛大学附属青岛市市立医院消化内一科1(266011) 急诊科2 普外科3

长链非编码RNA TUG1在胃癌患者中的表达及其对预后的影响

申 彤1*司君利2崔京远3亓玉琴1#吕 梅1

青岛大学附属青岛市市立医院消化内一科1(266011)急诊科2普外科3

胃肿瘤； 长链非编码RNA； TUG1； p27； 细胞周期蛋白D1

胃癌是全世界范围内最常见的消化道肿瘤之一[1]，死亡率居所有癌症的第二位[2]，大多数中晚期胃癌患者术后死于肿瘤复发[3]。因此，寻找一种较为有效的基因靶点从而早期发现、早期诊断胃癌已成为目前临床研究的重点。近年研究发现长链非编码RNA可起癌基因或抑癌基因的作用，通过调控相关基因的表达，参与不同类型肿瘤如乳腺癌的发生[4]。新近研究显示，牛磺酸上调基因1(taurine up-regulated gene 1,TUG1)在膀胱肿瘤、非小细胞肺癌[5-6]等的发展中起重要调控作用，但其在胃癌中的临床意义和生物学功能尚不清楚。本研究通过检测胃癌组织及其相应正常组织中TUG1、p27和cyclin D1的表达，旨在探讨TUG1在胃癌中的作用并分析其对胃癌预后的影响，从而探讨TUG1是否可作为胃癌较为敏感的分子学标记物和治疗靶点，以期为判断胃癌患者预后提供依据。

对象与方法

一、研究对象

收集2013年6月—2013年12月青岛市市立医院普外科行胃部手术的胃癌患者共48例，诊断均经病理检查确诊，其中男28例，女20例，平均年龄(60.0±9.2)岁。所有患者术前均未接受过全身化疗、局部放疗或其他抗肿瘤治疗。取患者肿瘤组织及其相应远端正常组织(距肿瘤边缘>5 cm处)，-80 ℃冰箱保存。参照2000年世界卫生组织(WHO)推荐的分化分级标准和2002年国际抗癌联盟TNM分期，对胃癌的分化程度和分期进行评估。本研究方案由青岛市市立医院伦理委员会审批通过，入选者或其家属均取得知情同意。对48例胃癌患者进行电话随访，随访时间从术后开始截至2016年12月31日。

二、主要试剂

cDNA合成试剂盒、2×Taq PCR MasterMix试剂盒、2×SYBR Green Mix(With ROX)试剂盒均购于美国Biomiga公司。GAPDH抗体、p27抗体、cyclin D1抗体均购于美国AbSci公司。羊抗兔IgG购于北京康为世纪生物科技有限公司。

三、研究方法

1.qRT-PCR法：取100 mg冻存组织，Trizol抽提试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，-80 ℃保存备用。TUG1引物上游：5’-TAG CAG TTC CCC AAT CCT TG-3’，下游：5’-CAC AAA TTC CCA TCA TTC CC-3’；以GAPDH作为内参，引物上游：5’-GAA GGT CGG AGT CAA CGG ATT-3’，下游：5’-CGC TCC TGG AAG ATG GTG AT-3’。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40个循环。每个样品设置2个复孔，并检测其熔解曲线。采用2-ΔΔCt法计算样品中目的基因的相对表达量。

2.蛋白质印迹法：RIPA裂解液裂解组织，匀浆，保留上清液，获得组织蛋白提取物，BCA法定量蛋白浓度。取70 μg蛋白样品，行SDS-PAGE电泳，转移至PVDF膜上，4 ℃过夜。加入p27兔多克隆抗体(工作浓度1∶200)、cyclin D1兔多克隆抗体(工作浓度1∶200)和GAPDH兔多克隆抗体(工作浓度1∶1 000)孵育3 h；TBST洗涤3次后，加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(工作浓度1∶2 000)室温孵育2 h，TBST洗涤3次。化学发光显影并观察结果。使用Quantity One图像分析软件，以目的蛋白条带灰度值与GAPDH条带灰度值比值表示目的蛋白的相对表达量。

四、统计学分析

结 果

一、TUG1表达及其与临床病理特征的关系

胃癌组织中TUG1 mRNA表达显著高于相应正常组织(6.18±0.19对5.09±0.16)，差异有统计学意义(P<0.05)。

根据TUG1 mRNA表达的中位数，将48例胃癌患者分为TUG1高表达组(n=35)和TUG1低表达组(n=13)，发现TUG1表达与性别、年龄和肿瘤大小无明显相关性，而与淋巴结转移、肿瘤分化程度和TNM分期有关(表1)。

表1 胃癌组织中TUG1表达与临床病理特征的关系(n)

二、p27、cyclin D1蛋白表达及其相关性

蛋白质印迹法显示，胃癌组织中p27蛋白表达明显低于正常组织，cyclin D1蛋白表达明显高于正常组织，差异均有统计学意义(P<0.01)(表2)。

Pearson相关性分析显示，胃癌组织中p27蛋白表达与cyclin D1蛋白表达呈负相关(r=-0.897，P<0.01)。

三、TUG1表达与p27、cyclin D1表达的相关性

Pearson相关性分析显示，胃癌组织中TUG1表达与p27表达呈负相关(r=-0.730，P<0.01)，而与cyclin D1表达呈正相关(r= 0.809，P<0.01)。

组别例数p27cyclinD1胃癌组织480．1709±0．02120．3417±0．0271正常组织480．3087±0．02520．2417±0．0173

四、TUG1表达与胃癌患者预后的关系

Kaplan-Meier分析显示，TUG1低表达组和高表达组的中位生存时间分别为34个月和23个月，TUG1高表达的胃癌患者生存时间明显低于低表达组，差异有统计学意义(P<0.01)(图1)。

图1 TUG1表达与胃癌患者预后的关系(Kaplan-Meier法)

讨 论

在人类基因组中，超过98%的基因不具有编码蛋白质的功能[7]，但可被转录，生成非编码RNA。长链非编码RNA是一类转录长度超过200个核苷酸的RNA分子的总称，因其无法编码蛋白质[8]，长期被认为是基因组学的“噪音”[9]。近年发现长链非编码RNA因在表观遗传学、转录以及转录后等多层面调控基因表达[10]而获得了越来越多的关注，其不但与个体生长发育有关，还对肿瘤发生、发展起至关重要的作用。

长链非编码RNA TUG1位于人染色体 22q12.2，长约7.1 kb，广泛存在于人体各种器官和细胞中，是视网膜和神经组织增殖必需的调控基因[11]。大量文献[5-6]显示，TUG1对膀胱肿瘤、非小细胞肺癌的发生起关键作用，但其在胃癌中的相关研究甚少。抑癌基因p27位于人染色体12p13，其表达产物p27蛋白是一种细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(CDKI)，通过抑制cyclin-CDKs的活性，阻止细胞从G1期进入S期，从而阻碍肿瘤的发生[12]。cyclin D1为一种重要的细胞周期正调控因子，其表达上调会导致细胞周期失衡从而发生恶性增殖[13]。有研究[14]表明，多梳蛋白抑制复合体2(PRC2)中EZH2可催化H3K27甲基化，进而抑制抑癌基因的表达。而Huang等[15]的研究表明在肝细胞癌中，TUG1能与PRC2复合物的EZH2、SUZ12结合并集中至抑癌因子KLF2启动子区，从而促进肝细胞癌的生长和转移。关于在胃癌组织中，TUG1是否通过PRC2途径抑制p27蛋白表达，进而导致胃癌的发生目前尚未见报道。

本研究结果显示在胃癌组织中TUG1表达明显高于相应正常组织，表明TUG1可能参与了胃癌的发生、发展。进一步分析TUG1表达与临床病理特征之间的关系发现，其表达与胃癌患者的性别、年龄和肿瘤大小无关，而与淋巴结转移、肿瘤分化程度和TNM分期有关，表明TUG1可能与胃癌浸润、转移有关。此外，胃癌组织TUG1表达与p27表达呈负相关，而与cyclin D1表达呈正相关，提示TUG1可能通过抑制p27表达、促进cyclin D1表达而促进胃癌的发生、发展。本研究还发现，TUG1高表达的胃癌患者生存时间明显低于低表达者，表明检测TUG1表达可作为判断胃癌患者预后的指标。

综上所述，本研究通过检测胃癌组织中TUG1、p27、cyclin D1的表达并分析其与胃癌临床病理特征和预后之间的关系，表明TUG1可能通过p27/cyclin D1途径诱导胃癌的发生，且高表达TUG1可能促进胃癌转移，进而影响患者预后。因此，TUG1有望作为一个潜在的胃癌分子标记物，为判断胃癌患者预后提供重要的理论依据。

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4 杨韬,李俊堂,王丽娟,等.干涉lncRNAs HOTAIR对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的影响[J].细胞与分子免疫学杂志,2012,28 (1):97-98.

5 Han Y,Liu Y,Gui Y,et al.Long intergenic non-coding RNA TUG1 is overexpressed in urothelial carcinoma of the bladder[J].J Surg Oncol,2013,107 (5):555-559.

6 Zhang EB,Yin DD,Sun M,et al.P53-regulated long non-coding RNA TUG1 affects cell proliferation in human non-small cell lung cancer,partly through epigenetically regulating HOXB7 expression[J].Cell Death Dis,2014,5:e1243.

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13 Wiech T,Nikolopoulos E,Lassman S,et al.Cyclin D1 expression is induced by viral BARF1 and is overexpressed in EBV-associated gastric cancer[J].Virchows Arch,2008,452 (6):621-627.

14 Cao R,Zhang Y.The functions of E(Z)/EZH2-mediated methylation of lysine 27 in histone H3[J].Curr Opin Genet Dev,2004,14 (2):155-164.

15 Huang MD,Chen WM,Qi FZ,et al.Long non-coding RNA TUG1 is up-regulated in hepatocellular carcinoma and promotes cell growth and apoptosis by epigenetically silencing of KLF2[J].Mol Cancer,2015,14:165.

(2017-05-30收稿；2017-07-25修回)

ExpressionofLongNon-codingRNATUG1anditsEffectonPrognosisofPatientsWithGastricCancer

SHENTong1,SIJunli2,CUIJingyuan3,QIYuqin1,LÜMei1.

1DepartmentofGastroenterologyⅠ,2DepartmentofEmergency,3DepartmentofGeneralSurgery,AffiliatedQingdaoMunicipalHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao,ShandongProvince(266011)

QI Yuqin,Email:17863939736@163.com

Stomach Neoplasms; Long Non-Coding RNA; TUG1; p27; Cyclin D1

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.003

*Email:448037357@qq.com

#本文通信作者，Email:17863939736@163.com

背景：近年胃癌的发生率呈逐步上升的趋势，长链非编码RNA牛磺酸上调基因1(TUG1)对胃癌的发生、发展可能起有一定的作用。目的研究TUG1在胃癌组织中的表达及其对预后的影响，并进一步探讨TUG1与p27蛋白、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)的相关性。方法收集2013年6月—2013年12月青岛市市立医院48例手术切除的胃癌组织及其相应远端正常组织，采用qRT-PCR法检测TUG1 mRNA表达，并分析其与临床病理特征的关系。采用蛋白质印迹法检测p27、cyclin D1蛋白表达，并分析其与TUG1表达的相关性。采用Kaplan-Meier法分析TUG1表达与预后的关系。结果胃癌组织中TUG1 mRNA表达显著高于相应正常组织(6.18±0.19对5.09±0.16，P<0.05)，且其表达与性别、年龄、肿瘤大小无关，与淋巴结转移、肿瘤分化程度和TNM分期有关(P<0.01)。胃癌组织中p27蛋白表达显著低于正常组织(0.170 9±0.021 2对0.308 7±0.025 2，P<0.01)，cyclin D1蛋白表达显著升高(0.341 7±0.027 1对0.241 7±0.017 3，P<0.01)，且p27蛋白表达与cyclin D1蛋白表达呈负相关(r=-0.897，P<0.01)。胃癌组织中TUG1表达与p27表达呈负相关(r=-0.730，P<0.01)，与cyclin D1表达呈正相关(r=0.809，P<0.01)。TUG1高表达的胃癌患者生存时间明显低于TUG1低表达者(P<0.05)。结论长链非编码RNA TUG1可能通过p27/cyclin D1途径在胃癌的发生、发展中起癌基因的作用，通过检测TUG1表达对判断胃癌患者预后具有潜在的价值。

Background:The incidence of gastric cancer is gradually rising in recent years,long non-coding RNA taurine up-regulated gene 1 (TUG1) may have certain effects on the occurrence and progression of gastric cancer.AimsTo study the expression TUG1 in gastric cancer tissue and its effect on prognosis of patients with gastric cancer,and study the correlation between TUG1 and p27,cyclin D1.MethodsSurgically resected gastric cancer tissues and corresponding distal normal tissues of 48 gastric cancer patients from June 2013 to December 2013 at Qingdao Municipal Hospital were collected.qRT-PCR was used to detect the mRNA expression of TUG1,and its relationship with clinicopathological features was analyzed.Protein expressions of p27 and cyclin D1 were determined by Western blotting,and correlation with expression of TUG1 was analyzed.Kaplan-Meier was used to analyze the relationship between expression of TUG1 and prognosis.ResultsThe mRNA expression of TUG1 in gastric cancer tissues was significantly higher than that in corresponding normal tissues (6.18±0.19vs.5.09±0.16,P<0.05),and was not correlated with gender,age,tumor size,but correlated with lymph node metastasis,tumor differentiation and TNM staging (P<0.01).The protein expression of p27 was significantly decreased in gastric cancer tissues than in normal tissues (0.170 9±0.021 2vs.0.308 7±0.025 2,P<0.01),while protein expression of cyclin D1 was significantly increased (0.341 7±0.027 1vs.0.241 7±0.017 3,P<0.01),and the expression of p27 was negatively correlated with expression of cyclin D1 in gastric cancer tissues (r=-0.897,P<0.01).The expression of TUG1 was negatively correlated with expression of p27 (r=-0.730,P<0.01),and was positively correlated with expression of cyclin D1 (r=0.809,P<0.01) in gastric cancer tissues.The median survival time was shorter in gastric cancer patients with high-expressed TUG1 than in patients with low-expressed TUG1 (P<0.05).ConclusionsLong non-coding RNA TUG1 plays a role of cancer gene in the development of gastric cancer through p27/cyclin D1 pathway.Detection of expression of TUG1 has important significance on the prediction of prognosis of gastric cancer patients.