具核梭杆菌通过调控miR-181b在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制

林 欣 何 杰 魏 芳 赵 冲 曾利红 吴 琼 黄惠康 杜艳蕾 王 红

广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科 广州消化疾病中心(510180)

具核梭杆菌通过调控miR-181b在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制

林 欣 何 杰 魏 芳 赵 冲 曾利红 吴 琼 黄惠康 杜艳蕾 王 红*

广州医科大学附属广州市第一人民医院消化内科广州消化疾病中心(510180)

具核梭杆菌； miR-181b； 肿瘤坏死因子α； 结直肠肿瘤

肠道菌群在结直肠癌发病中的作用日益受到关注。Mira-Pascual等[1]发现腺瘤和结直肠癌黏膜的菌群结构与正常对照明显不同，其中结直肠癌组具核梭杆菌(Fusobacteriumnucleatum，Fn)和肠杆菌数量显著增多。目前发现与结直肠癌发生相关的病原菌可能包括Fn、致病性大肠杆菌、产毒性脆弱拟杆菌等[2]。Strauss等[3]发现IBD患者肠黏膜中Fn呈高丰度，提示Fn可能在炎症相关的结肠癌发病机制中起重要作用。在移植瘤ApcMin/+小鼠模型中发现，Fn具有募集髓样肿瘤免疫细胞的能力，能形成炎性微环境[4]。炎性微环境在肿瘤的发生、发展中发挥重要的促进作用，炎性因子介导的信号通路或许参与肿瘤细胞的恶性演进，认识并深入了解炎性微环境的调控机制尤为重要。

最近一项研究[5]表明，在Fn刺激巨噬细胞的炎症反应过程中，可诱导产生某些miRNA，通过增加炎性因子水平来实现调节宿主细胞对病原体反应的能力。然而在肠道炎症反应过程中起重要作用的miRNA尚不清楚。人miRNA-181基因由miR-181a-1、miR-181a-2、miR-181b-2、miR-181b-2、miR-181c和miR-181d组成[6]，是一个重要的基因表达调控因子[7]，近期研究发现，miR-181a在单核巨噬细胞中能调节炎症反应，与炎症因子呈负相关[8]。然而，Fn是否通过miR-181发挥作用，以及结肠癌细胞形成炎性微环境的机制尚不明确。miR-181与其靶基因在结直肠癌中可能参与的信号通路尚待研究。本研究通过构建Fn感染结肠癌Caco-2细胞炎症模型，并运用miRNA测序技术找出差异表达的miRNA，旨在探讨结肠癌细胞形成炎性微环境的可能机制，为研究结肠癌发生机制提供一定的理论基础。

材料与方法

一、菌株、细胞株和主要试剂

1.菌株：Fn标准菌株ATCC 10953购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心。

2.细胞株：人结直肠腺癌细胞株Caco-2购自美国ATCC细胞库。人淋巴细胞由广州市第一人民医院消化内科健康志愿者全血样本中获取并签署知情同意书，研究方案通过医院伦理委员会审查。

3.主要试剂：psiCHECKTM-2载体(Promega公司)。染料法Hairpin-it hsa-miR-181b-5p定量和U6校准qRT-PCR试剂盒(上海吉玛制药技术有限公司)，miR-181b mimics、inhibitor模拟物以及对应的阴性对照RNA(苏州吉玛基因股份有限公司)。RNA提取试剂、逆转录试剂、qPCR试剂(日本TAKARA公司)，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司)，肿瘤坏死因子α(TNF-α)检测试剂盒(武汉优尔生商贸有限公司)，TNF-α抗体、β-actin抗体、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Abcam公司)，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo Science有限公司)，人淋巴细胞分离液Histopaque®-1077(Sigma公司)，ECL试剂盒(Millipore公司)。

二、研究方法

1.细菌培养：取Fn菌株在哥伦比亚血平板上划线，37 ℃孵箱厌氧培养48 h至单个菌落明显可见。鉴定、传代，挑取单个菌落接种至含BHI培养基的无菌离心管中，37 ℃孵箱厌氧培养 24 h，使细菌处于生长对数期，制备细菌悬液。

2.细胞培养和分组：Caco-2细胞以含20% FBS的DMEM培养基培养，调整细胞密度为1×106～2×106/个，接种于6孔板，培养在37 ℃、5% CO2环境中。待细胞贴壁融合度达80%时，弃培养基，按照MOI=200∶1(细菌∶细胞)，处理组细胞中加入Fn菌体悬液(2×108～4×108CFU)，对照组以相应体积培养基替代，培养6 h后收集样本。

3.miRNA测序：收集细胞裂解样本，送广州市锐博生物科技有限公司行miRNA测序。

4.细胞转染：Fn感染Caco-2细胞接种于6孔板，将转染试剂分别与200 pmol/孔miR-181b mimics和inhibitor混合后转染细胞，6 h后细胞换液，48 h后收集上清，收集细胞提取总RNA或总蛋白。

5.qRT-PCR法：取各组细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA，行实时荧光定量PCR。TNF-α引物上游：5’-CCT CCT CTC TGC CAT CAA GA-3’，下游：5’-CTG AGT CGG TCA CCC TTC TC-3’。以β-actin作为内参，引物上游：5’-TGA CGT GGA CAT CCG CAA AG-3’，下游：5’-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GG-3’。每个样本设置2个复孔，采用2-ΔΔCt法计算目的基因的表达。

6.ELISA法：取各组细胞培养液上清，1 000×g室温离心20 min，按ELISA试剂盒说明书检测上清液中TNF-α含量。每组实验重复3次。

7.蛋白质印迹法：取各组细胞，以蛋白裂解液裂解细胞，提取总蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白样品行SDS-PAGE凝胶电泳，5%脱脂奶粉室温封闭1 h。加入TNF-α一抗(工作浓度1∶2 500)、β-actin一抗(工作浓度1∶10 000)4 ℃孵育过夜。加入二抗室温孵育1 h，ECL法显影。凝胶图像处理系统行灰度扫描，分析目的蛋白相对表达量。

8.淋巴细胞提取：抽取健康志愿者抗凝全血，以RPMI-1640培养基按1∶1稀释。加入淋巴细胞分离液，400×g室温离心30 min。吸取上、中层界面处一白色云雾层狭窄带，加入RPMI-1640培养基，离心。末次离心后，弃上清，加入RPMI-1640培养基重悬细胞。适当稀释后，计数细胞。

9.Transwell小室法：水化小室，37 ℃孵箱培养1 h。分别设置细菌细胞共培养组、阴性对照组、阳性对照组，将对应培养基加入至下室，小室加入1.5×105个/孔人淋巴细胞，37 ℃、5% CO2培养 4 h。取出小室，洗涤，固定，染色，透明，封片。光学显微镜下阅片，每个小室膜随机选取5个高倍镜视野(×400)，计数所有穿膜淋巴细胞数，取均值。

三、统计学分析

结 果

一、Fn感染Caco-2细胞可释放炎性因子、招募淋巴细胞

与共培养前细胞相比，与Fn共培养6 h后细胞形态变得不规则，细胞膜受到破坏，细胞间联系疏松不紧密(图1A)。

与对照组相比，Fn组炎性因子TNF-α、IL-1β、RELM-β mRNA表达显著升高(P<0.05)(图1B)。Fn组TNF-α mRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)(图1B、1C)，培养上清液中TNF-α含量亦显著高于对照组(P<0.01)(图1D)。

Transwell小室结果显示，与阴性对照组相比，阳性对照组和Fn组穿膜淋巴细胞数均显著增高(P<0.05)(图1E)。提示含有TNF-α的Fn与细胞共培养上清可募集淋巴细胞。另一方面，该现象进一步验证了Fn感染Caco-2细胞炎症模型的可靠性。

与对照组比较，*P<0.05，**P<0.01

A：Fn感染Caco-2细胞诱导的细胞形态改变；B：Fn感染Caco-2细胞中炎性因子mRNA表达(qRT-PCR法)；C：TNF-α蛋白表达(蛋白质印迹法)；D：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；E：穿膜淋巴细胞数量(Transwell小室法，×400)

图1 Fn感染Caco-2细胞可释放炎性因子、招募淋巴细胞

二、Fn感染Caco-2细胞抑制miR-181b表达

miRNA测序结果显示Fn组miR-181b表达显著低于对照组(表1)。qRT-PCR法对测序结果进行验证发现，Fn组miR-181b表达显著低于对照组(t=5.390，P=0.001 0)(图2)。

表1 两组间miR-181b表达的miRNA测序结果

图2 Fn感染Caco-2细胞可抑制miR-181b表达(qRT-PCR法)

三、Fn通过抑制miR-181b表达上调TNF-α

与对照组相比，miR-181b mimics+Fn组TNF-α mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)，上清液中TNF-α含量亦显著降低(P<0.05)，说明miR-181b表达与TNF-α表达呈负相关(图3)。

四、TNF-α为miR-181b的靶基因

miR-181b inhibitor组TNF-α mRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)，上清液中TNF-α含量亦显著升高(P<0.05)(图4A～4C)。进一步说明miR-181b与TNF-α呈负调控关系。

使用三种生物信息学工具预测发现miR-181b-5p种子区与TNF-α 3’UTR有结合位点，且位点一致(图4D)，双荧光素酶活性检测亦证实两者的靶标关系(图4E)。在转染克隆有TNF-α基因3’UTR质粒的实验中miR-181b-5p组与空白对照组、阴性对照组相比差异均有统计学意义(P=0.028，P=0.016)，说明miR-181b-5p能通过结合TNF-α基因3’UTR影响其荧光活性改变。在转染克隆有突变型TNF-α基因3’UTR质粒的实验中，miR-181b-5p mimics组与空白对照组和阴性对照组相比无明显差异(P>0.05)，说明miR-181b-5p不能通过结合突变型TNF-α基因3’UTR影响其荧光活性改变，结合位点突变完全。而miR-181b受到抑制后，在转染克隆有TNF-α基因3’UTR质粒的实验中，miR-181b-5p inhibitor组与空白对照组、阴性对照组相比差异均有统计学意义(P=0.011，P=0.007)，说明miR-181b-5p inhibitor能封闭miR-181b-5p，通过抑制结合TNF-α基因3’UTR影响其荧光活性改变。而在转染克隆有突变型TNF-α基因3’UTR质粒的实验中，miR-181b-5p inhibitor组与空白对照组和阴性对照组相比无明显差异(P>0.05)。

五、Fn通过调控miR-181b在结肠癌细胞中形成炎性微环境

Fn与过表达miR-181b的Caco-2细胞共培养上清液中，穿膜淋巴细胞数较阴性对照组显著降低(P<0.05)，而阴性对照组与空白对照组相比无明显差异(图5)。说明在Fn感染的情况下，上调miR-181b表达能使结肠癌细胞中TNF-α表达降低，降低招募的淋巴细胞数。

讨 论

Fn是一种具有侵袭性[9]、黏附性[10]的厌氧菌，可释放促炎因子。Fn相关结直肠癌的研究[11-12]发现，Fn能通过自身结构及其代谢产物等组分，刺激宿主细胞产生一系列炎性因子，如TNF-α、IL-6、IL-8、PGE2等，从而参与结直肠癌的发生、发展。

A：TNF-α mRNA表达(qRT-PCR法)；B：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；C：TNF-α蛋白表达(蛋白质印迹法)

A：TNF-α mRNA表达(qRT-PCR法)；B：上清液中TNF-α含量(ELISA法)；C：TNF-α蛋白表达(蛋白质印迹法)；D：三种生物信息学工具发现miR-181b与TNF-α结合位点一致；E：293T细胞转染重组载体和突变体质粒后活性比较

图4 TNF-α为miR-181b的靶基因

图5 Fn通过上调miR-181b表达降低招募的淋巴细胞数(Transwell小室法，×400)

Caco-2细胞是一种培养达到融合时表达正常肠上皮细胞分化特征的结肠癌细胞，且为合适的转染宿主。Trainer等[13]对19种结肠癌细胞株的致瘤性进行分级，发现Caco-2细胞属于Ⅱ级结肠原发性腺癌细胞，可形成腺状和管状组织结构，并具有分泌黏蛋白以及形成成纤维细胞的能力，长期培养后可致肿瘤形成。Caco-2细胞常用于肠道癌前病变细胞模型，多项研究[14-17]通过构建Caco-2细胞模型研究IBD、腺瘤型息肉等疾病，因此本研究选用Caco-2作为细胞模型。本研究发现Fn组TNF-α mRNA和蛋白表达均显著增高，提示Fn能促进Caco-2细胞中TNF-α的表达。最近一项研究[18]证实了ETBF与IL-17结合能诱导MO-MDSC分化，促进结直肠癌的发生。Fn亦具有募集MDSC的能力，可形成肿瘤炎性微环境而起促癌的作用。

miRNA对结肠癌细胞周期和增殖的调控具有重要意义。Yang等[19]发现Fn感染小鼠中miR-21表达显著增加。应用miR-21抑制剂能抑制与Fn共培养结肠癌细胞的增殖和侵袭。早期研究显示某些miRNA由巨噬细胞炎症反应过程中诱导产生，具有调节宿主细胞对病原体反应的能力，而病原体本身又能反过来调节miRNA表达[20-21]。Ito等[22]通过比较腺瘤组织等癌前病变和结直肠癌组织发现，Fn表达与miR-31表达可能存在一定的关系，但仍需进一步明确其关系。Nosho等[5]认为Fn或许能通过miR-21增加IL-10和PGE2水平，抑制肿瘤微环境中的抗肿瘤T细胞介导的特异性免疫应答。有研究[23]发现miR-155能通过扩大炎症效应促进肿瘤发生，在炎症与癌症之间起桥梁的关系。本研究通过对细胞模型行miRNA测序发现，Fn组中miR-181b表达显著降低。有研究[24]发现miR-181b-1受到激活后，能通过CYLD途径实现炎症-癌变的过程。提示miR-181b可能在Fn感染Caco-2细胞导致的炎症过程中扮演重要角色，可能是“炎症-肿瘤”转化过程中新的节点miRNA分子。

本研究使用生物信息学工具检测miR-181b与TNF-α的结合位点，并采用双荧光素酶实验对两者的靶标关系进行检测。结果发现TNF-α为miR-181b的靶基因，两者呈负调控关系。Fn感染能促进结肠癌细胞中TNF-α表达，并具有募集淋巴细胞的能力。抑制细胞中miR-181b表达，可诱导TNF-α释放增多。当Fn感染存在的情况下，恢复细胞中miR-181b水平，TNF-α表达依然下调，miR-181b对细胞的内在调控作用起主要的影响。因此，推测Fn可能通过抑制miR-181b上调TNF-α的表达，从而形成炎性微环境，最终在Fn感染所致的反复局部炎症反应过程中诱导结直肠癌的发生。

综上所述，本研究结果表明Fn感染的结肠癌细胞中miR-181b表达下降，并通过靶向调节其下游基因TNF-α，招募淋巴细胞向炎症部位聚集，形成炎性微环境，由于反复炎症感染的存在，为结直肠癌的发生提供了病理生理基础，提示miR-181b在Fn参与的炎症相关性结直肠癌的发生和发展过程中可能发挥重要作用。然而，目前对Fn诱导miR-181b表达的机制尚不明确，且“Fn感染-炎症-肿瘤”整个过程中涉及的关键基因的动态变化仍未完全清楚，有待后续进一步深入研究。

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(2017-04-13收稿；2017-05-11修回)

MechanismofFusobacteriumnucleatumviaRegulatingmiR-181bforFormingAnInflammatoryMicroenvironmentinColonCancerCells

LINXin,HEJie,WEIFang,ZHAOChong,ZENGLihong,WUQiong,HUANGHuikang,DUYanlei,WANGHong.

DepartmentofGastroenterology,GuangzhouFirstPeople’sHospital,GuangzhouMedicalUniversity;GuangzhouDigestiveDiseaseCenter,Guangzhou(510180)

WANG Hong,Email:wong.hong@163.com

Fusobacteriumnucleatum; miR-181b; Tumor Necrosis Factor-alpha; Colorectal Neoplasms

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.10.004

*本文通信作者，Email:wong.hong@163.com

背景：具核梭杆菌(Fn)是口腔常见的致病菌，研究发现Fn与结直肠癌的发生、发展密切相关，尤其是炎症相关性结直肠癌。目的探讨Fn感染在结肠癌细胞中形成炎性微环境的机制。方法构建Fn感染Caco-2细胞的炎症模型，行miRNA测序。将miR-181b mimics或inhibitor转染Fn感染的Caco-2细胞。以qRT-PCR和蛋白质印迹法分别检测TNF-α mRNA和蛋白表达，ELISA法检测上清液中TNF-α含量，Transwell小室法检测穿膜淋巴细胞数。结果Fn组TNF-α mRNA和蛋白表达均显著高于对照组(P<0.05)，上清液中TNF-α含量显著升高(P<0.05)，穿膜淋巴细胞数量明显增多(P<0.05)。miRNA测序和qRT-PCR结果均显示，Fn组miR-181b表达较对照组显著降低(P<0.05)。与对照组相比，miR-181b mimics+Fn组TNF-α mRNA和蛋白表达显著降低(P<0.05)；而miR-181b inhibitor组TNF-α mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05)。生物信息学工具和双荧光素酶检测证实TNF-α可能为Caco-2细胞中miR-181b的靶基因。结论Fn通过抑制Caco-2细胞中miR-181b表达而上调TNF-α表达，募集淋巴细胞形成炎性微环境。

Background:Fusobacteriumnucleatum(Fn) is a common oral pathogen.Studies have shown that Fn is closely related to the occurrence and development of colorectal cancer,especially the inflammation-related colorectal cancer.AimsTo investigate the mechanism of Fn in forming an inflammatory microenvironment in colon cancer cells.MethodsAn inflammation model of Caco-2 cells infected by Fn was constructed,and miRNA sequencing was performed.miR-181b mimics or inhibitor was transfected into Fn infected Caco-2 cells.mRNA and protein expressions of TNF-α were determined by qRT-PCR and Western blotting,respectively,and concentration of TNF-α in supernatant was measured by ELISA,number of lymphocyte penetrating the membrane was measured by Transwell chamber.ResultsCompared with control group,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly increased (P<0.05),concentration of TNF-α in supernatant was significantly increased (P<0.05),and number of lymphocyte penetrating the membrane was significantly increased in Fn group (P<0.05).miRNA sequencing and qRT-PCR results showed that expression of miR-181b was significantly decreased in Fn group than in control group (P<0.05).Compared with control group,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly decreased in miR-181b mimics+Fn group (P<0.05),however,mRNA and protein expressions of TNF-α were significantly increased in miR-181b inhibitor group (P<0.05).Bioinformatics tools and Luciferase assay confirmed that TNF-α might be the target gene of miR-181b in Caco-2 cells.ConclusionsFn can up-regulate the expression of TNF-α by inhibiting miR-181b in Caco-2 cells and recruiting lymphocytes to form an inflammatory microenvironment.