艰难梭菌感染：临床表型与细菌毒素相关吗？

陈 烨 林倩云

南方医科大学附属南方医院消化内科 广东省胃肠实验重点实验室(510515)



·特约文稿·

艰难梭菌感染：临床表型与细菌毒素相关吗？

陈 烨 林倩云

南方医科大学附属南方医院消化内科 广东省胃肠实验重点实验室(510515)

艰难梭菌(C.difficile)是院内获得性腹泻和伪膜性肠炎的首要病原体，产毒菌株主要通过产生毒素A和毒素B引起腹泻、肠道炎症甚至肠坏死。有研究表明，C.difficile在体内的产毒水平是影响C.difficile相关性疾病(CDAD)临床表型的重要因素，而细菌毒素与临床表型的具体联系尚不明确。本文主要针对CDAD临床表型以及毒素蛋白的结构、功能及其调控等方面进行论述，探讨细菌毒素与临床表型的关系，为进一步深入研究C.difficile的致病机制并探索新的药物治疗靶点奠定理论基础。

艰难梭菌； 表型； 细菌毒素类； 基因； 基因调控网络

艰难梭菌(Clostridiumdifficile,C.difficile)为革兰阳性厌氧芽孢杆菌，为人类肠道正常定植菌，主要在人与人之间通过粪-口途径传播，在肠道菌群紊乱时大量繁殖，继而破坏肠黏膜屏障，导致以腹泻为主要表现的一系列临床症候群，为临床最常见的条件致病菌之一[1]。正常肠道菌群可有效抑制C.difficile的繁殖，而抗菌药物等因素所致的菌群平衡破坏可导致该菌过度生长，致病菌株分泌毒素A(TcdA, 肠毒素和细胞毒素)和毒素B(TcdB, 细胞毒素)，破坏肠道屏障功能，引起C.difficile相关性疾病(C.difficile-associated disease, CDAD)，其严重程度可自轻微自限性腹泻至伪膜性肠炎、脓毒性休克甚至多器官衰歇致死[2]。目前C.difficile已成为院内获得性感染性腹泻最普遍的病因，几乎所有伪膜性肠炎均由C.difficile引起，并可导致患者平均住院时间延长，基础疾病加重，死亡率显著增加[3]。此外，C.difficile感染已被证实是炎症性肠病病情加重或复发的危险因素，而炎症性肠病的生物治疗药 物英夫利昔单抗又可增加C.difficile感染机会[4]。CDAD已成为全球范围内广受关注的一个公共卫生问题。

C.difficile的恒化培养和动物实验研究已证实某些抗菌药物能诱导C.difficile生长及其毒素分泌，患者年龄、基础疾病以及产生毒素中和抗体的水平是影响CDAD患病率、疾病严重程度和复发风险的重要因素[4-5]。此外，菌株之间的差异，如产毒能力、隶属不同血清组以及菌体表层蛋白质不同也可影响CDAD的临床表现。已有研究证实患者的腹泻频率、腹痛程度与粪便C.difficile毒素水平相关，其受到细菌和宿主两方面因素的影响。本文主要讨论C.difficile毒素及其调控机制与临床表型的关系。

一、CDAD临床表型

CDAD的诊断主要依据临床表现(腹泻、肠梗阻、中毒性巨结肠)、产毒C.difficile的微生物证据或结肠镜检查发现伪膜性结肠炎等[6]。根据临床症状和实验室检查结果可将CDAD分为以下几种表型。

1. 无症状携带者：无典型的C.difficile感染症状或体征[1]。

2. 轻度感染：只有门诊患者发生的C.difficile感染才考虑诊断为轻度感染；表现为轻度腹泻(不成形便3～5次/d)，无发热，轻度腹部不适或压痛，无显著实验室指标异常[1,6]。

3. 中度感染：非血性腹泻，中度腹部不适或压痛，恶心，偶有呕吐，脱水，白细胞计数>1.5×1010/L，血尿素氮和肌酐水平高于正常值[1]。

4. 重度感染：成人严重C.difficile感染定义为发作时伴有一种或多种临床表现/症状(表1)[6]；儿童C.difficile感染的严重程度尚无统一定义。

表1 C. difficile重度感染特征

上述特征>1条即提示C.difficile重度感染

5. 复杂性C.difficile感染：C.difficile感染发作时并发中毒性巨结肠，因严重脓毒症入住重症监护病房，需手术治疗或可能致死的临床情况。

6. 复发性C.difficile感染：定义为前一次C.difficile感染症状缓解后8 周内再次发作[6]。复发应与初始治疗未获缓解的迁延性腹泻相鉴别，后者提示需寻找其他引起腹泻的原因。如无其他诊断，需考虑此类患者为难治性C.difficile感染。复发性C.difficile感染常由与原来相同的菌株或其他C.difficile菌株再感染所致。分子生物学研究已证实多达半数的复发性疾病是再次感染，而非原有菌株感染的复发。

7. 难治性C.difficile感染：定义为一线药物治疗3～4 d后无明显的临床改善[6]。

二、C.difficile毒力因子

C.difficile致病依赖于细菌产生的毒力因子，包括 细菌染色体致病决定区(pathogenicity locus, PaLoc)编码的毒素蛋白[7]，以及细菌黏附性、运动性等因素。C.difficile产生的毒素主要作用于肠上皮细胞[2]，毒素入胞并在胞质内激活，诱发上皮细胞坏死，进而导致肠黏膜完整性缺失，宿主暴露于肠道微生物并激活一系列炎症反应[8-9]。

1. TcdA和TcdB

①蛋白结构和致病机制：大部分产毒菌株的PaLoc在C.difficile染色体上的位点一致，可编码5种毒素相关蛋白，变异菌株的PaLoc也可位于非典型区域[7]。由PaLoc编码的毒素主要是大分子分泌蛋白TcdA和TcdB，包含4个同源结构域。毒素蛋白N末端包含Rho和Rac葡萄糖基转移酶结构域(GTD)，通过糖基化致宿主细胞质中的Rho和Rac GTP酶失活，瓦解细胞骨架，破坏紧密连接，导致肠上皮完整性缺失[2,10]。

GTD与半胱氨酸蛋白酶结构域(CPD)相连，CPD在真核细胞质中与六磷酸肌醇结合，自催化裂解释放GTD片段，研究证实CPD更高效的自催化反应可增加C.difficile毒力[11]。已有研究发现了一种有效的半胱氨酸蛋白酶小分子抑制剂可阻断GTD片段释放，使TcdA/B毒力丧失[12]。动物实验表明该抑制剂的使用可减轻C.difficile感染小鼠肠上皮的损伤程度，为C.difficile感染的临床治疗提供了一个很有潜力的治疗策略。TcdA和TcdB的另两个同源结构域包括可嵌入宿主细胞膜的转运功能区和梭菌重复寡肽序列(CROP)构成的受体结合区。TcdA的CROP区域包含多达38个重复序列，可结合细胞膜热休克蛋白gp96和碳水化合物。TcdB的CROP重复序列较少，CROP片段完全缺失的TcdB在较高浓度下仍可表现出细胞毒性，但TcdB的受体是何种分子尚不明确。有研究发现硫酸软骨素蛋白多糖4(CSPG4)可作为TcdB的细胞受体，其N末端的胞外段可与CROP片段以外的区域结合[13]，但尚未见肠上皮细胞中存在CSPG4表达的报道。近年来针对受体结合区以阻断毒素与宿主细胞结合的药物也在不断尝试中。

②基因变异与毒力改变：通过敲除不同毒力基因继而感染仓鼠，TcdA和TcdB在体内发挥的毒性作用逐渐被阐明。A-B-菌株毒力完全丧失，几乎不致病；A-B+菌株感染仓鼠的结肠病理评分较之A+B+菌株无明显降低，表明TcdB能单独介导结肠炎症；TcdA的潜在作用尚存争议，有文献报道A+B-菌株不会引起结肠炎[14]，但也有实验证明TcdA可单独介导肠炎发生[15-16]。这些不一致的发现可能与菌株、实验动物及其微生物群组成以及抗菌药物敏感性的差异有关。综合多个实验室的随访研究显示，TcdB是介导结肠上皮损伤、炎症和死亡的主要毒力因子，而TcdA是一个作用相对较弱的炎症反应驱动者，但其在仓鼠模型中的毒性作用较明显[17]。

不同C.difficile菌株的tcdB基因序列存在显著多样性，据推断毒素编码序列的差异可能导致菌株之 间毒性的差异[18-19]。从爆发流行的027/BI/NAP1菌株中提纯的TcdB毒力是标准菌株的4倍甚至更高[20]。环境因素是否促进毒素多样化、宿主环境的选择是否增加或减少菌株毒性尚待研究。

③毒素的调控机制：PaLoc还编码另3个调控蛋白TcdR、TcdC和TcdE。TcdR为转录起始因子σ，促进RNA聚合酶与tcdA和tcdB启动子结合。C.difficile进入静止生长期时，TcdR可启动tcdA和tcdB基因转录[21]；C.difficile进入对数生长期时，TcdC大量表达，可抑制tcdA和tcdB基因转录[22]。已证实tcdC序列缺失与027/BI/NAP1菌株的高毒力有关，支持TcdC对毒素具有负向调控作用[23]。然而在体外培养条件下，无论是敲除标准菌株的tcdC基因还是修复027/BI/NAP1菌株突变的tcdC基因都不能改变毒素分泌水平[24-25]。因此，TcdC对tcdA和tcdB基因表达是否具有确切的负向调控作用还需深入探究。

TcdA和TcdB缺乏传统的分泌信号序列，目前一般认为TcdE与毒素的外分泌有关。与其他C.difficile毒素相关蛋白一样，对TcdE介导毒素分泌的必要性一直存在争议。有研究认为TcdE是介导毒素释放不可或缺的蛋白[26]，也有研究证实在TcdE完全失活的情况下毒素依然可以分泌[27]。

笔者等的研究发现，PaLoc中存在tcdA、tcdB、tcdR、tcdC和tcdE五个基因连锁突变的产毒菌株与临床伪膜性肠炎的发生高度相关(P<0.001)，并在机体内导致更严重的炎症水平(P<0.05)(数据尚未发表)。检测菌株是否存在毒素基因连锁突变或许可尽早采取针对性预防措施，提前预防CDAD病情恶化，有望为C.difficile感染的控制提供更有效的手段。

2. 二元毒素：一些C.difficile菌株，尤其是高毒力的027/BI/NAP1菌株，除表达TcdA和TcdB外，还表达另一种毒素，称之为二元毒素或C.difficile转移酶(CDT)，编码基因位于PaLoc之外。CDT的存在使患者死亡率明显增高，是北美和欧洲的主要暴发流行菌株，我国也已发现027菌株，但并无证据显示其有流行趋势[28]。CDT包括两个独立的蛋白亚基，具有ADP-核糖转移酶活性的CdtA能不可逆地解聚肌动蛋白细胞骨架；具有结合能力的CdtB能与宿主细胞结合，促进CdtA释放至胞质[2,29]。CDT的核糖基化作用可干扰构成细胞膜的肌动蛋白网聚合，诱导肠上皮细胞微管突起形成，更多的纤连蛋白黏附至细胞表面，从而显著增强C.difficile黏附靶细胞的能力[30]。因此，携带二元毒素意味着菌株有更强的毒力。

三、结语

欧美有C.difficile感染的广泛报道并对其进行长期监测和研究，亚洲对C.difficile感染的研究相对较少，主要集中于一些发达国家或地区，如日本、韩国、中国台湾等国家和地区。中国大陆各级医疗机构中，C.difficile感染并不是一个需申报的感染。此外，限于技术和重视程度等原因，目前只有北京、上海、广州等大城市的部分医院或研究机构关注这一感染。然而，随着抗菌药物的广泛应用以及高毒力致病菌株的出现，近年来中国CDAD 发病率和死亡率不断增高。

目前，C.difficile感染已成为基础研究、公共卫生和临床治疗等多个领域广为关注的问题，但其发病机制仍未完全明确，对于重症或反复发作性病例缺乏确实有效的治疗措施。即使应用对C.difficile敏感的万古霉素或甲硝唑治疗，仍有15%～25%的患者复发[31-32]，目前对C.difficile最为有效的药物非达霉素治疗的早期复发率仍可达8%，晚期复发率高达20%[33]，027型变异菌株复发率甚至高达 50%～80%；而标准抗菌药物治疗易进一步加重菌群失调，引起感染复发。因此，有必要探索新的C.difficile感染治疗模式。研究C.difficile的毒素结构、功能及其调控机制，将为在基因水平开发新的干扰细菌毒素的药物提供依据，为C.difficile感染的临床防控开辟一条新的道路。

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(2017-01-09收稿)

ClostridiumdifficileInfection: Is Clinical Phenotype Associated with Bacterial Toxin?

CHEN Ye, LIN Qianyun.

Department of Gastroenterology, Nanfang Hospital, Southern Medical University, Guangdong Provincial Key Laboratory of Gastroenterology, Guangzhou (510515)

Clostridiumdifficile(C.difficile) infection is the leading cause of hospital-acquired diarrhea and pseudomembranous colitis.C.difficile-associated disease (CDAD) is mediated mainly by two bacterial toxins, TcdA and TcdB, which cause the diarrhea, as well as colitis and even intestinal necrosis. It has been indicated that level ofC.difficiletoxin is an important factor influencing the clinical phenotype of CDAD, however, the exact association between toxin and clinical phenotype remains unclear. In this article, we summarized the clinical phenotype of CDAD, the structure, function and regulatory mechanism ofC.difficiletoxin and discussed the relationship betweenC.difficiletoxin and clinical phenotype, which may help to understand the pathogenic mechanism and provide possible therapeutic target forC.difficileinfection.

Clostridiumdifficile; Phenotype; Bacterial Toxins; Genes; Gene Regulatory Networks

10.3969/j.issn.1008-7125.2017.07.001